As probas de metilación do ADN combinadas con teléfonos intelixentes para o cribado precoz de tumores e cribado de leucemia cunha precisión do 90,0%.

A detección precoz do cancro baseada na biopsia líquida é unha nova dirección de detección e diagnóstico do cancro proposta polo Instituto Nacional do Cancro dos Estados Unidos nos últimos anos, co obxectivo de detectar cancro precoz ou incluso lesións precancerosas. Foi moi utilizado como biomarcador novo para o diagnóstico precoz de diversas malignidades, incluíndo cancro de pulmón, tumores gastrointestinais, gliomas e tumores xinecolóxicos.

A aparición de plataformas para identificar os biomarcadores da paisaxe de metilación (metilscape) ten o potencial de mellorar significativamente o cribado precoz do cancro existente, poñendo aos pacientes na primeira etapa tratable.

Recentemente, os investigadores desenvolveron unha plataforma de detección sinxela e directa para a detección de paisaxes de metilación baseada en nanopartículas de ouro decoradas por cisteamina (Cyst/AUNPs) combinadas cun biosensor baseado en teléfonos intelixentes que permite un cribado precoz rápido dunha ampla gama de tumores. O cribado precoz da leucemia pódese realizar aos 15 minutos despois da extracción do ADN dunha mostra de sangue, cunha precisión do 90,0%. O título do artigo é a detección rápida do ADN do cancro en sangue humano mediante AuNPs capas de cisteamina e un smartphone con aprendizaxe automática。

Figura 1. Pódese realizar unha plataforma de detección sinxela e rápida para o cribado de cancro a través de compoñentes Cyst/AuNPS en dous pasos sinxelos.

Isto móstrase na figura 1. En primeiro lugar, utilizouse unha solución acuosa para disolver os fragmentos de ADN. Engadiuse o quiste/AuNPs á solución mixta. O ADN normal e maligno ten diferentes propiedades de metilación, obtendo fragmentos de ADN con diferentes patróns de autoensamblaxe. O ADN normal agrégase con soltura e, eventualmente, agregan os quistes/AuNPs, o que resulta na natureza cambiada en vermello do quiste/AuNPS, de xeito que se pode observar un cambio de cor de vermello a vermello a simple vista. En contraste, o perfil único de metilación do ADN do cancro leva á produción de clústers máis grandes de fragmentos de ADN.

As imaxes de placas de 96 pozos tomáronse usando unha cámara de teléfonos intelixentes. O ADN do cancro foi medido por un teléfono intelixente equipado con aprendizaxe de máquinas en comparación cos métodos baseados na espectroscopia.

Cribado de cancro en mostras de sangue reais

Para ampliar a utilidade da plataforma de detección, os investigadores aplicaron un sensor que distinguía con éxito entre o ADN normal e o canceroso en mostras de sangue reais. Os patróns de metilación nos sitios CPG regulan epixenicamente a expresión xénica. En case todos os tipos de cancro, observáronse cambios na metilación do ADN e, polo tanto, na expresión de xenes que promoven a tumourigénese.

Como modelo para outros cancro asociados á metilación do ADN, os investigadores usaron mostras de sangue de pacientes con leucemia e controis saudables para investigar a eficacia da paisaxe de metilación na diferenciación de cancro leucémico. Este biomarcador de paisaxe de metilación non só supera os métodos de cribado de leucemia rápida existentes, senón que demostra a viabilidade de estenderse ata a detección precoz dunha ampla gama de cancro usando este ensaio sinxelo e sinxelo.

Analizouse o ADN de mostras de sangue de 31 pacientes con leucemia e 12 individuos sans. Como se mostra na trama da caixa na figura 2a, a absorbancia relativa das mostras de cancro (ΔA650/525) foi inferior á do ADN das mostras normais. Isto debeuse principalmente á hidrofobicidade mellorada que provocou unha densa agregación de ADN do cancro, que impediu a agregación de quistes/AuNPs. Como resultado, estas nanopartículas foron completamente dispersas nas capas exteriores dos agregados de cancro, o que deu lugar a unha dispersión diferente dos quistes/AuNPs adsorbidos en agregados normais e de ADN do cancro. A continuación, xeráronse curvas ROC variando o limiar dun valor mínimo de ΔA650/525 a un valor máximo.

Figura 2. (a) Valores de absorbancia relativa das solucións de cistos/Aunps que mostran a presenza de ADN normal (azul) e cancro (vermello) en condicións optimizadas

(DA650/525) de parcelas; (b) Análise e avaliación de ROC das probas de diagnóstico. (c) Matriz de confusión para o diagnóstico de pacientes normais e de cancro. (d) Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (PPV), valor preditivo negativo (NPV) e precisión do método desenvolvido.

Como se mostra na figura 2b, a área baixo a curva ROC (AUC = 0,9274) obtida para o sensor desenvolvido mostrou alta sensibilidade e especificidade. Como se pode ver na trama da caixa, o punto máis baixo que representa o grupo de ADN normal non está ben separado do punto máis alto que representa o grupo de ADN do cancro; Polo tanto, a regresión loxística utilizouse para diferenciar os grupos normais e o cancro. Dado un conxunto de variables independentes, estima a probabilidade de que se produza un evento, como un cancro ou un grupo normal. A variable dependente oscila entre 0 e 1. O resultado é, polo tanto, unha probabilidade. Determinamos a probabilidade de identificación do cancro (P) baseada en ΔA650/525 do seguinte xeito.

onde b = 5.3533, w1 = -6.965. Para a clasificación da mostra, unha probabilidade inferior a 0,5 indica unha mostra normal, mentres que unha probabilidade de 0,5 ou superior indica unha mostra de cancro. A figura 2C describe a matriz de confusión xerada a partir da validación cruzada de licenza, que se empregou para validar a estabilidade do método de clasificación. A figura 2D resume a avaliación da proba de diagnóstico do método, incluída a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo positivo (PPV) e o valor preditivo negativo (NPV).

Biosensores baseados en teléfonos intelixentes

Para simplificar aínda máis as probas de mostra sen o uso de espectrofotómetros, os investigadores usaron intelixencia artificial (AI) para interpretar a cor da solución e distinguir entre individuos normais e cancerosos. Dado isto, a visión da computadora usouse para traducir a cor da solución Cyst/AuNPS en ADN normal (púrpura) ou ADN canceroso (vermello) usando imaxes de placas de 96 pozos tomadas a través dunha cámara de teléfono móbil. A intelixencia artificial pode reducir os custos e mellorar a accesibilidade na interpretación da cor das solucións de nanopartículas e sen o uso de accesorios de teléfonos intelixentes de hardware óptico. Finalmente, adestráronse dous modelos de aprendizaxe de máquinas, incluído o bosque aleatorio (RF) e a máquina vectorial de soporte (SVM) para construír os modelos. Tanto os modelos RF como SVM clasificaron correctamente as mostras como positivas e negativas cunha precisión do 90,0%. Isto suxire que o uso de intelixencia artificial na biosensación baseada en teléfonos móbiles é bastante posible.

Figura 3. (a) Clase de destino da solución rexistrada durante a preparación da mostra para o paso de adquisición de imaxes. (b) Exemplo de imaxe tomada durante o paso de adquisición de imaxes. (c) Intensidade de cor da solución de cistos/AuNPS en cada pozo da placa de 96 pozos extraída da imaxe (B).

Usando Cyst/AuNPs, os investigadores desenvolveron con éxito unha sinxela plataforma de detección para a detección de paisaxes de metilación e un sensor capaz de distinguir o ADN normal do ADN do cancro cando se usa mostras de sangue reais para o cribado de leucemia. O sensor desenvolvido demostrou que o ADN extraído de mostras de sangue real foi capaz de detectar de forma rápida e rendible pequenas cantidades de ADN de cancro (3NM) en pacientes con leucemia en 15 minutos e mostrou unha precisión do 95,3%. Para simplificar aínda máis as probas de mostras eliminando a necesidade dun espectrofotómetro, a aprendizaxe automática usouse para interpretar a cor da solución e diferenciar entre individuos normais e cancerosos mediante unha fotografía de teléfono móbil e tamén se puido conseguir a precisión no 90,0%.

Referencia: doi: 10.1039/d2ra05725e