Factores de interferencia nas reaccións de PCR

Durante a reacción de PCR, a miúdo atópanse algúns factores interferentes.
Debido á moi alta sensibilidade da PCR, a contaminación considérase un dos factores máis importantes que afectan os resultados da PCR e pode producir resultados falsos positivos.
Igualmente críticas son as diversas fontes que conducen a resultados falsos negativos.Se unha ou máis partes esenciais da mestura de PCR ou a propia reacción de amplificación se inhiben ou interfiren, o ensaio diagnóstico pode verse obstaculizado.Isto pode levar a unha eficiencia reducida e mesmo a resultados falsos negativos.
Ademais da inhibición, pode producirse a perda da integridade do ácido nucleico diana debido ás condicións de envío e/ou almacenamento antes da preparación da mostra.En particular, as altas temperaturas ou o almacenamento inadecuado poden provocar danos nas células e nos ácidos nucleicos.A fixación de células e tecidos e a incorporación de parafina son causas ben coñecidas da fragmentación do ADN e un problema persistente (ver Figuras 1 e 2).Nestes casos, incluso o illamento e purificación óptimos non axudarán.

Figura 1 |Efecto da inmobilización na integridade do ADN
A electroforese en xel de agarosa mostrou que a calidade do ADN illado de seccións de parafina das autopsias variou considerablemente.ADN de diferentes lonxitudes de fragmentos medias estivo presente nos extractos dependendo do método de fixación.O ADN conservouse só cando se fixou en mostras conxeladas nativas e en formalina neutra tamponada.O uso dun fixador de Bouin fortemente ácido ou formalina que contén ácido fórmico sen tampón provocou unha perda significativa de ADN.A fracción restante está moi fragmentada.
Á esquerda, a lonxitude dos fragmentos exprésase en pares de quilobases (kbp)

Figura 2 |Perda da integridade das dianas de ácidos nucleicos
(a) Unha brecha de 3′-5′ en ambas as febras producirá unha rotura no ADN diana.a síntese de ADN aínda ocorrerá no fragmento pequeno.Non obstante, se falta un sitio de recocido do cebador no fragmento de ADN, só se produce a amplificación lineal.No caso máis favorable, os fragmentos poden resaturarse entre si, pero os rendementos serán pequenos e por debaixo dos niveis de detección.
(b) A perda de bases, debido principalmente á depurinación e á formación de dímeros de timidina, leva a unha diminución do número de enlaces H e unha diminución da Tm.Durante a fase de quentamento alongada, os cebadores fundiranse do ADN da matriz e non se recocirán mesmo en condicións menos rigorosas.
(c) As bases de timina adxacentes forman un dímero TT.
Outro problema común que adoita ocorrer no diagnóstico molecular é a liberación menos que óptima de ácidos nucleicos diana en comparación coa extracción con fenol-cloroformo.En casos extremos, isto pode asociarse con falsos negativos.Pódese aforrar moito tempo coa lise fervendo ou a dixestión enzimática dos restos celulares, pero este método adoita producir unha baixa sensibilidade da PCR debido á liberación insuficiente de ácido nucleico.

Inhibición da actividade da polimerase durante a amplificación

En xeral, a inhibición úsase como concepto de recipiente para describir todos os factores que conducen a resultados de PCR subóptimos.Nun sentido estritamente bioquímico, a inhibición limítase á actividade do encima, é dicir, reduce ou impide a conversión de substrato-produto mediante a interacción co sitio activo da ADN polimerase ou o seu cofactor (por exemplo, Mg2+ para a ADN polimerase Taq).
Os compoñentes da mostra ou varios tampóns e extractos que conteñen reactivos poden inhibir directamente o encima ou atrapar os seus cofactores (por exemplo, EDTA), inactivando así a polimerase e, á súa vez, provocando unha diminución ou un falso negativo dos resultados da PCR.
Non obstante, moitas interaccións entre os compoñentes da reacción e os ácidos nucleicos que conteñen diana tamén se designan como "inhibidores da PCR".Unha vez que se interrompe a integridade da célula polo illamento e se libera o ácido nucleico, pódense producir interaccións entre a mostra e a súa solución circundante e a fase sólida.Por exemplo, os 'scavengers' poden unirse ao ADN monocatenario ou bicatenario mediante interaccións non covalentes e interferir co illamento e a purificación ao reducir o número de dianas que finalmente chegan ao recipiente de reacción da PCR.
En xeral, os inhibidores da PCR están presentes na maioría dos fluídos corporais e reactivos utilizados para probas de diagnóstico clínico (urea en ouriños, hemoglobina e heparina en sangue), suplementos dietéticos (compoñentes orgánicos, glicóxeno, graxa, ións Ca2+) e compoñentes do ambiente (fenois). , metais pesados)

Pódense atopar inhibidores de PCR máis frecuentes en bacterias e células eucariotas, ADN non obxectivo, macromoléculas de unión ao ADN de matrices de tecidos e equipos de laboratorio como luvas e plásticos.A purificación dos ácidos nucleicos durante ou despois da extracción é o método preferido para eliminar os inhibidores da PCR.
Hoxe en día, varios equipos de extracción automatizados poden substituír moitos protocolos manuais, pero nunca se logrou a recuperación e/ou purificación do 100% dos obxectivos.Os posibles inhibidores aínda poden estar presentes nos ácidos nucleicos purificados ou poden ter feito efecto.Existen diferentes estratexias para reducir o impacto dos inhibidores.A elección da polimerase adecuada pode ter un impacto significativo na actividade do inhibidor.Outros métodos comprobados para reducir a inhibición da PCR son o aumento da concentración de polimerase ou a aplicación de aditivos como BSA.
A inhibición das reaccións de PCR pódese demostrar mediante o uso do control interno de calidade do proceso (IPC).
Débese ter coidado de eliminar todos os reactivos e outras solucións do kit de extracción, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol e fenol, do illado de ácido nucleico mediante un paso de lavado exhaustivo.Dependendo da súa concentración, poden activar ou inhibir a PCR.