Realización de catro ensaios de amplificación de ácidos nucleicos para identificar o SARS-CoV-2 en Etiopía

Grazas por visitar Nature.com. Estás a usar unha versión do navegador con compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez. Usa os botóns Anterior e Seguinte para moverte por tres diapositivas á vez ou usa os botóns deslizantes ao final para moverte por tres diapositivas á vez.
Desde o brote da enfermidade por coronavirus (COVID-19) de 2019, desenvolvéronse moitas probas comerciais de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) en todo o mundo, que se converteron en ensaios estándar. Aínda que se desenvolveron e aplicaron rapidamente varias probas a probas de diagnóstico de laboratorio, o rendemento destas probas non se avaliou en diversos contextos. Polo tanto, este estudo tivo como obxectivo avaliar o rendemento dos ensaios Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech utilizando o Estándar de Referencia Composto (CRS). O estudo realizouse no Instituto de Saúde Pública de Etiopía (EPHI) do 1 ao 30 de decembro de 2020. Extraéronse 164 mostras nasofarínxeas utilizando o kit QIAamp RNA mini e o sistema de preparación de mostras de ADN de Abbott. Das 164 mostras, o 59,1 % foron positivas e o 40,9 % foron negativas para CRS. A positividade de Sansure Biotech foi significativamente baixa en comparación coa CRS (p < 0,05). A positividade de Sansure Biotech foi significativamente baixa en comparación coa CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Os resultados positivos de Sansure Biotech foron significativamente menores en comparación con CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech tivo significativamente menos resultados positivos en comparación con CRS (p < 0,05).A concordancia xeral das catro análises foi do 96,3–100 % en comparación coa CRS. Ademais da baixa taxa de positividade do ensaio Sansure Biotech, o rendemento dos catro ensaios foi case comparable. Como tal, o ensaio Sansure Biotech [Só para investigación (RUO)] require validación adicional para o seu uso en Etiopía. Finalmente, debería considerarse a posibilidade de realizar investigacións adicionais para avaliar os ensaios coas afirmacións axeitadas do fabricante.
As probas de laboratorio forman parte do Plan estratéxico de preparación e resposta á enfermidade por coronavirus de 2019 (COVID-19) da Organización Mundial da Saúde (OMS). A OMS aconsella que os países deben crear capacidade de laboratorio para mellorar a preparación, a xestión adecuada de casos, a vixilancia e a resposta rápida aos desafíos de saúde pública. Isto suxire que o papel do laboratorio é fundamental para caracterizar a enfermidade e a epidemioloxía dos axentes infecciosos emerxentes e controlar a súa propagación.
O diagnóstico da COVID-19 require información epidemiolóxica e médica, signos/síntomas persoais e datos radiográficos e de laboratorio2. Desde que se informou do brote de COVID-19 en Wuhan, China, desenvolvéronse moitas probas comerciais de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) en todo o mundo. A reacción en cadea da polimerase con transcrición inversa en tempo real (rRT-PCR) utilizouse como método rutineiro e estándar para o diagnóstico de laboratorio da infección por síndrome respiratoria aguda grave 2 (SARS-CoV-2)3. A detección molecular do SARS-CoV-2 baséase normalmente nos xenes N (xene da proteína da nucleocápside), E (xene da proteína da envoltura) e RdRp (xene da ARN polimerase dependente de ARN) na rexión ORF1a/b (xene do marco de lectura aberto 1a/b) identificada a partir do xenoma viral. Considéranse as principais rexións conservadas que se atopan nos xenomas virais para o recoñecemento de virus4. Entre estes xenes, os xenes RdRp e E teñen unha alta sensibilidade de detección analítica, mentres que o xene N ten unha baixa sensibilidade analítica5.
O rendemento das probas de PCR pode variar dependendo de varios factores, como: reactivos de extracción, reactivos de amplificación/detección, método de extracción, calidade da máquina de PCR e outros instrumentos. En abril de 2020, máis de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nove países recibiran a autorización de uso de emerxencia (EUA) para o diagnóstico da COVID-196. En Etiopía, utilízanse máis de 14 plataformas de PCR en tempo real para a detección por PCR do SARS-CoV-2 en 26 institucións de saúde pública, incluíndo ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7. Ademais, hai dispoñibles varios kits de probas de PCR, como a proba de Daan Gene, a proba de Abbott SARS-CoV-2, a proba de Sansure Biotech e a proba BGI do SARS-CoV-2. Aínda que a rRT-PCR é moi sensible, algúns pacientes con COVID-19 informan de resultados falsos negativos debido a copias insuficientes de ácido ribonucleico (ARN) viral nas mostras debido a unha recollida, transporte, almacenamento e manipulación inadecuados, e probas de laboratorio. condicións e accións do persoal8. Ademais, a mala manipulación de mostras ou controis, o axuste do limiar do ciclo (Ct) e a reactividade cruzada con outros ácidos nucleicos patóxenos ou ARN inactivo/residual do SARS-CoV-2 poden levar a resultados falsos positivos nos ensaios de rRT-PCR9. Polo tanto, está claro que as probas de PCR poden identificar portadores de fragmentos de xenes, xa que nin sequera poden distinguir entre xenes virais verdadeiramente activos, polo que as probas só poden identificar portadores e non pacientes10. Polo tanto, é importante avaliar o rendemento diagnóstico utilizando métodos estándar no noso contexto. Aínda que hai moitos reactivos NAAT dispoñibles no Instituto de Saúde Pública de Etiopía (EPHI) e en todo o país, aínda non se informou de ningunha avaliación comparativa da súa eficacia. Polo tanto, este estudo tivo como obxectivo avaliar o rendemento comparativo dos kits dispoñibles comercialmente para a detección do SARS-CoV-2 mediante rRT-PCR utilizando mostras clínicas.
Incluíronse neste estudo un total de 164 participantes con sospeita de COVID-19. A maioría das mostras procedían de centros de tratamento (118/164 = 72 %), mentres que os 46 participantes restantes (28 %) procedían de centros non tratados. Entre os participantes non tratados no centro, 15 (9,1 %) tiñan casos clinicamente sospeitosos e 31 (18,9 %) tiñan contactos de casos confirmados. Noventa e tres (56,7 %) dos participantes eran homes e a idade media (± DE) dos participantes era de 31,10 (± 11,82) anos.
Neste estudo, determináronse as taxas de positivos e negativos de catro probas para a COVID-19. Así, as taxas de positivos do ensaio Abbott SARS-CoV-2, o ensaio Daan Gene 2019-nCoV, o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foron do 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % e 55,5 %, respectivamente. As puntuacións do estándar de referencia composto (CRS) positivo e negativo foron do 97 (59,1 %) e do 67 (40,9 %), respectivamente (Táboa 1). Neste estudo, a definición de CRS baseouse na regra de "calquera positivo", segundo a cal, de catro resultados de probas, dous ou máis resultados de probas que deron o mesmo resultado consideráronse verdadeiros positivos ou negativos.
Neste estudo, atopamos unha porcentaxe de concordancia negativa (NPA) do 100 % (IC do 95 %: 94,6–100) para todas as análises en comparación coa CRS. A análise de Sansure Biotechnology mostrou un PPA mínimo do 93,8 % (IC do 95 %: 87,2-97,1) e a análise de Daan Gene 2019-nCoV tivo unha concordancia global do 99,4 % (IC do 95 %: 96,6-99,9). En contraste, a concordancia global entre o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foi do 98,8 % e o 96,3 %, respectivamente (Táboa 2).
O coeficiente de concordancia kappa de Cohen entre os resultados do ensaio CRS e o SARS-CoV-2 de Abbott foi totalmente consistente (K = 1,00). Do mesmo xeito, os valores kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV tamén son totalmente consistentes con CRS (K ≥ 0,925). Nesta análise comparativa, a proba de chi ao cadrado (proba de McNemar) mostrou que os resultados do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foron significativamente diferentes dos resultados do CRS (p = 0,031) (Táboa 2).
Como se mostra na figura.1 a porcentaxe do valor Ct máis baixo (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (xene combinado RdRp e N) foi do 87,6 % e o valor Ct do xene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentaxe de valor Ct baixo (< 20 Ct) foi do 50,3 % e o valor Ct alto (36–40 Ct) foi do 3,2 %. 1 a porcentaxe do valor Ct máis baixo (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (xene combinado RdRp e N) foi do 87,6 % e o valor Ct do xene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentaxe de valor Ct baixo (< 20 Ct) foi do 50,3 % e o valor Ct alto (36–40 Ct) foi do 3,2 %.Como se mostra na figura.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) 6си 8 и N) значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20%, лста) а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, a porcentaxe do valor Ct máis baixo (< 20 Ct) na análise do SARS-CoV-2 de Abbott (xene combinado RdRp e N) foi do 87,6 %, e a análise do valor Ct do xene ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentaxe de valor Ct baixo (< 20 Ct) representou o 50,3 % e o Ct de valor alto (36–40 Ct) o 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20%，San Biotech，876. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36)–40 Ct (36)–40 Ct的百分比为3,2%. Como se mostra na Figura 1, a porcentaxe de valor Ct máis baixa (< 20 Ct) da proba Abbott SARS-CoV-2 (combinación do xene RdRp e N) é do 87,6 %, o valor Ct do xene ORF1a/b da proba Sansure Biotech 2019-nCoV mostra unha porcentaxe baixa de Ct (< 20 Ct) do 50,3 % e a porcentaxe de Ct (36–40 Ct) do 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) como non hai máis Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV покат.зка Como se mostra na Figura 1, o ensaio Abbott SARS-CoV-2 (combinando os xenes RdRp e N) tivo o valor porcentual de Ct máis baixo (< 20 Ct) cun 87,6 %, mentres que o valor Ct do xene ORF1a/b no estudo de Sansure Biotech 2019: a análise do nCoV mostrou un Ct baixo. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 2%. A porcentaxe de valores (< 20 Ct) foi do 50,3 % e a porcentaxe de valores de Ct altos (36–40 Ct) foi do 3,2 %.A proba B de Abbott para o SARS-CoV-2 rexistrou valores de Ct superiores a 30. Por outra banda, no ensaio BGI para o SARS-CoV-2, o xene ORF1a/b presentou un valor Ct alto (> 36 Ct), unha porcentaxe do 4 % (Fig. 1). Por outra banda, no ensaio BGI para o SARS-CoV-2, o xene ORF1a/b presentou un valor Ct alto (> 36 Ct), unha porcentaxe do 4 % (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент котол 4% (páxina 1). Por outra banda, na análise de BGI, o xene ORF1a/b do SARS-CoV-2 presentou un valor Ct alto (> 36 Ct), cuxa porcentaxe foi do 4 % (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比一分比伈帀4% Por outra banda, na detección de SARS-CoV-2 mediante BGI, a porcentaxe do xene ORF1a/b cun valor Ct alto (>36 Ct) é do 4 % (Figura 1). Non é posible que o SARS-CoV-2 de BGI non se engade de ORF1a/b e que non ten datos de Ct (>36 Ct) сос 1% (>36 Ct). Por outra banda, na análise BGI SARS-CoV-2, a porcentaxe de xenes ORF1a/b con valores de Ct altos (>36 Ct) foi do 4 % (Fig. 1).
Neste estudo, tomamos 164 mostras nasofarínxeas. Para todos os tipos de ensaios, o illamento e a amplificación do ARN realizáronse empregando os métodos e kits recomendados polos respectivos fabricantes.
Este estudo demostrou que a proba de Abbott para o SARS-CoV-2 ten o mesmo rendemento de detección que a CRS, cun 100 % de positivos, negativos e concordancia xeral. A concordancia kappa de Cohen é de 1,00, o que indica unha concordancia total coa CRS. Un estudo similar realizado pola Universidade de Washington nos Estados Unidos descubriu que a sensibilidade e a especificidade globais da proba de Abbott para o SARS-CoV-2 foron do 93 % e do 100 %, respectivamente, en comparación co ensaio determinado no laboratorio (LDA) dos CDC. 11. O sistema de detección de Abbott para o SARS-CoV-2 baséase na detección combinada simultánea dos xenes N e RdRp, xa que ambos os xenes son máis sensibles, o que minimiza os falsos negativos 12. Un estudo realizado en Viena, Austria, tamén mostrou que os grandes volumes de mostra de extracción e os grandes volumes de eluente de detección minimizaban os efectos de dilución e aumentaban a eficiencia da detección 13. Polo tanto, a combinación perfecta de Abbott para o ensaio SARS-CoV-2 pódese asociar cun sistema de detección de plataforma que detecta simultaneamente xenes combinatorios, extrae un gran número de mostras (0,5 ml) e usa unha gran cantidade de eluente (40 µl).
Os nosos resultados tamén mostraron que o rendemento de detección da proba xenética de Daan foi case o mesmo que o da CRS. Isto é consistente cun estudo14 realizado na Universidade de Anhui en Huainan, China, e coa afirmación do fabricante dun 100 % de concordancia positiva. A pesar dos informes de resultados consistentes, unha mostra deu un falso negativo despois de volver analizar o mesmo eluato, pero deu positivo nos ensaios Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019. Isto suxire que pode haber variabilidade nos resultados entre os diferentes tipos de ensaios. Non obstante, no estudo levado a cabo na China15, o resultado do ensaio do xene Daan foi significativamente diferente (p < 0,05) en comparación co seu ensaio de referencia definido no laboratorio. Non obstante, no estudo levado a cabo na China15, o resultado do ensaio do xene Daan foi significativamente diferente (p < 0,05) en comparación co seu ensaio de referencia definido no laboratorio. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителедовании (5) их лабораторного эталонного анализа. Non obstante, nun estudo realizado na China15, o resultado da análise de Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) da súa análise de referencia de laboratorio.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значителоp < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Non obstante, nun estudo realizado na China15, os resultados da proba xenética de Daan foron significativamente diferentes (p < 0,05) en comparación coa súa proba de laboratorio de referencia.Esta discrepancia pode deberse á sensibilidade da proba de referencia para detectar o SARS-CoV-2, e pode ser importante realizar máis estudos para determinar a causa.
Ademais, o noso estudo avaliou o rendemento comparativo do ensaio BGI do SARS-CoV-2 con CRS, mostrando unha excelente porcentaxe de concordancia positiva (PPA = 97,9%), porcentaxe de concordancia negativa (NPA = 100%) e porcentaxe de concordancia xeral por xénero (OPA). = 98,8%). Os valores Kappa de Cohen mostraron unha boa concordancia (K = 0,975). Estudos realizados nos Países Baixos16 e na China15 mostraron resultados consistentes. A proba BGI do SARS-CoV-2 é unha proba de detección dun só xene (ORF1a/b) que utiliza 10 µl de eluato de amplificación/detección. A pesar da boa concordancia estatística cos nosos resultados de referencia, a análise pasou por alto dúas mostras positivas (1,22%) da mostra total. Isto pode ter enormes implicacións clínicas para a dinámica de transmisión tanto a nivel de paciente como de comunidade.
Outra análise comparativa incluída neste estudo foi o ensaio rRT-PCR (RUO) para nCoV-2019 de Sansure Biotech; a porcentaxe de concordancia global foi do 96,3 %. A forza da concordancia tamén se determinou mediante o valor Kappa de Cohen, que foi de 0,925, o que indica unha concordancia total coa CRS. Unha vez máis, os nosos resultados son idénticos aos dos estudos realizados na Universidade Central do Sur en Changsha (China) e no Departamento de Laboratorio Clínico do Hospital Popular de Liuzhou (Cidade de Liuzhou, China)17. Aínda que se rexistrou a boa concordancia estatística mencionada anteriormente, a proba de chi ao cadrado (proba de MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio de Sansure Biotech presentou unha diferenza estatisticamente significativa en comparación co CRS (p < 0,005). Aínda que se rexistrou a boa concordancia estatística mencionada anteriormente, a proba de chi ao cadrado (proba de MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio de Sansure Biotech presentou unha diferenza estatisticamente significativa en comparación co CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соотировано сототвере,тий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистичесри злески злесча зальтат по сравнению с CRS (p < 0,005). Aínda que se rexistrou a boa concordancia estatística anterior, a proba de chi ao cadrado (proba de McNemar) mostrou que o resultado do ensaio de Sansure Biotech tiña unha diferenza estatisticamente significativa en comparación co CRS (p < 0,005).Sansure Biotech相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， biotech 滓与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。＼。。）） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий хи-квадратрат) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech e CRS. Malia a boa concordancia estatística mencionada anteriormente, a proba de chi ao cadrado (proba de McNemar) mostrou unha diferenza estatisticamente significativa (p < 0,005) entre o ensaio de Sansure Biotech e o CRS.Detectouse que seis mostras (3,66 %) deron falsos negativos en comparación coa CRS (Táboa suplementaria 1); isto é moi importante, especialmente dada a dinámica de transmisión do virus. Os datos anteriores tamén corroboran esta baixa taxa de detección15.
Neste estudo, determináronse os valores de Ct para cada ensaio e plataforma respectiva, sendo o valor medio de Ct máis baixo rexistrado no ensaio Abbott SARS-CoV-2. Este resultado pode estar relacionado co sistema de probas xenéticas combinadas simultáneas de Abbott para a detección do SARS-CoV-2. Polo tanto, segundo a Figura 1, o 87,6 % dos resultados de Abbott SARS-CoV-2 tiveron valores de Ct inferiores a 20. Só un pequeno número de resultados de mostras (12,4 %) estaban no rango de 20 a 30. Non se rexistraron valores de Ct superiores a 30. Ademais do uso por parte de Abbott do formato de probas xenéticas de panel SARS-CoV-2, este resultado pode estar relacionado co límite inferior de detección (32,5 copias de ARN/ml)18, que é tres veces inferior ao límite inferior da empresa de 100 copias de ARN/ml)19.
Este estudo ten algunhas limitacións: en primeiro lugar, non dispoñemos de métodos estándar/de referencia [como a carga viral ou outras probas de laboratorio (LDA)] debido á falta de recursos. En segundo lugar, todas as mostras empregadas neste estudo foron frotis nasofarínxeos, mentres que os resultados non foron aplicables a outros tipos de mostras e, en terceiro lugar, o tamaño da nosa mostra foi pequeno.
Este estudo comparou o rendemento de catro ensaios de rRT-PCR para o SARS-CoV-2 empregando mostras nasofarínxeas. Todos os ensaios de detección tiveron un rendemento case comparable, coa excepción do ensaio de Sansure Biotech. Ademais, identificouse unha baixa taxa de positividade no ensaio Sansure Biotech en comparación co CRS (p < 0,05). Ademais, identificouse unha baixa taxa de positividade no ensaio Sansure Biotech en comparación co CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнс, 5 (CRS, 5). Ademais, a proba de Sansure Biotech mostrou unha baixa porcentaxe de resultados positivos en comparación con CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по срав не, CRS5 (CRS5). Ademais, o ensaio de Sansure Biotech tivo unha taxa de positividade máis baixa en comparación co CRS (p < 0,05).A análise de Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA e concordancia xeral superou o 93,5 %, cun valor de concordancia de forza Kappa de Cohen de 0,925. Finalmente, o ensaio Sansure Biotech (RUO) necesita unha maior validación para o seu uso en Etiopía, e debería considerarse a posibilidade de realizar máis investigacións para avaliar as afirmacións dos fabricantes individuais.
O deseño do estudo comparativo realizouse en catro centros sanitarios de Addis Abeba: o Hospital Eka Kotebe, o Centro de Tratamento da Igrexa do Milenio, o Hospital Memorial Zewooditu e o Hospital Especializado en Tuberculose de St. Peter. Os datos recolléronse entre o 1 e o 31 de decembro de 2020. Os centros médicos para este estudo elixíronse a propósito en función do seu elevado número de casos e da dispoñibilidade dos principais centros de tratamento na cidade. Do mesmo xeito, os instrumentos, incluídos os instrumentos de PCR en tempo real ABI 7500 e Abbott m2000, seleccionáronse segundo as recomendacións dos fabricantes de reactivos NAAT, e seleccionáronse catro kits de detección de PCR para este estudo, xa que a maioría dos laboratorios de Etiopía utilizaban polo menos catro deles. Proba xenética, proba de Abbott para o SARS-CoV-2, proba de Sansure Biotech e proba BGI para o SARS-CoV-2 realizadas durante o estudo.
As probas para o SARS-CoV-2 realizáronse do 1 ao 30 de decembro de 2020 empregando 3 ml de medio de transporte viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de individuos baixo investigación por COVID-19 derivados a EPHI. As mostras nasofarínxeas foron recollidas por recolectores de mostras adestrados e enviadas a EPHI en paquetes triplos. Antes do illamento de ácidos nucleicos, a cada mostra asígnaselle un número de identificación único. A extracción realízase de cada mostra inmediatamente despois da súa chegada utilizando métodos de extracción manuais e automáticos. Así, para a extracción automática de Abbott m2000, extraéronse 1,3 ml (incluíndo 0,8 ml de volume morto e 0,5 ml de volume de entrada de extracción) da mostra de cada mostra e pasáronse polo sistema de preparación de mostras de ADN de Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EUA). ) Incluíuse un lote de 96 [92 mostras, dous controis de detección e dous controis sen molde (NTC)] no proceso xeral (recuperación e detección) de dúas roldas de extracción de SARS-CoV-2 (EUA) en tempo real. Do mesmo xeito, para a extracción manual, use as mesmas mostras (para a extracción e o descubrimento automáticos). Así, ao longo do proceso, alícuotáronse e extraéronse 140 µl de mostras usando o kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemaña) en lotes de 24 (incluíndo 20 mostras, dous controis de ensaio e dous NTC) durante nove roldas. Os eluatos extraídos manualmente amplificáronse e detectáronse usando un termociclador ABI 7500 usando o ensaio SARS-CoV-2 BGI, o ensaio Daan Gene e o ensaio Sansure Biotech.
O illamento e a purificación automatizados do ARN viral do SARS-CoV-2 seguen o principio das esferas magnéticas empregando reactivos de preparación de mostras de ADN de Abbott. A inactivación das mostras e a solubilización das partículas virais lévase a cabo empregando un deterxente que contén isotiocianato de guanidina para desnaturalizar a proteína e inactivar a ARNase. O ARN sepárase entón da proteína mediante separación en fase sólida empregando sílice, é dicir, o sal de guanidinio e o pH alcalino do tampón de lise promoven a unión dos ácidos nucleicos á sílice (SiO2). O paso de enxague elimina as proteínas e os residuos restantes para producir unha solución transparente. O ARN transparente íllase a partir de micropartículas a base de sílice empregando o campo magnético do instrumento20,21. Por outra banda, o illamento e a purificación manuais do ARN lévanse a cabo mediante o método da columna de centrifugación empregando centrifugación en lugar dun soporte magnético e separación das micropartículas do eluente.
A proba de detección de SARS-CoV-2 en tempo real de Abbott (Abbott Molecular, Inc.) realizouse segundo as instrucións do fabricante, que recibiu a EUA19,22 da OMS e da FDA. Neste protocolo, a inactivación da mostra antes da extracción realizouse nun baño de auga a 56 °C durante 30 minutos. Despois da inactivación do virus, a extracción de ácidos nucleicos realizouse nun instrumento Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM utilizando un sistema de preparación de mostras de ADN Abbott m2000, segundo o fabricante. A amplificación e a detección realizáronse utilizando un instrumento Abbott m2000 RT-PCR, e realizouse unha detección dual para os xenes RdRp e N. ROX) e VIC P (colorante patentado) para a segmentación e detección de controis internos, o que permite a detección simultánea de ambos produtos de amplificación 19.
O método de detección de amplificación deste kit baséase na tecnoloxía RT-PCR dun só paso. Daan Gene Technology seleccionou os xenes ORF1a/b e N como rexións conservadas para detectar a amplificación da rexión diana. Deseñáronse cebadores específicos e sondas fluorescentes (sondas do xene N marcadas con FAM, sondas ORF1a/b marcadas con VIC) para detectar o ARN do SARS-CoV-2 en mostras. O eluente final e as mesturas mestra preparáronse engadindo 5 µl de eluente a 20 µl da mestura mestra ata un volume final de 25 µl. A amplificación e a detección realizáronse simultaneamente nun instrumento de PCR en tempo real ABI 750024.
Os xenes ORF1a/b e N detectáronse empregando o kit de diagnóstico de ácidos nucleicos nCoV-2019 de Sansure Biotech (detección por PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada xene diana seleccionando o canal FAM para a rexión ORF1a/b e o canal ROX para o xene N. A este kit de ensaio, engádense o eluente e os reactivos da mestura mestra do seguinte xeito: prepare 30 µl de reactivo da mestura mestra e 20 µl de mostra eluída para a detección/amplificación. Para a PCR en tempo real utilizouse o ABI 750025 para a amplificación/detección.
A proba BGI para o SARS-CoV-2 é un kit de rRT-PCR en tempo real fluorescente para o diagnóstico da COVID-19. A rexión diana está situada na rexión ORF1a/b do xenoma do SARS-CoV-2, que é un método de detección dun só xene. Ademais, o xene humano de referencia β-actina é un xene diana regulado internamente. A mestura mestra prepárase mesturando 20 µl do reactivo da mestura mestra e 10 µl da mostra de ARN extraída nunha placa de pozos26. Utilizouse un instrumento de PCR cuantitativa en tempo real fluorescente ABI 7500 para a amplificación e a detección. Toda a amplificación de ácidos nucleicos, as condicións de execución da PCR para cada ensaio e a interpretación dos resultados realizáronse segundo as instrucións do fabricante respectivo (Táboa 3).
Nesta análise comparativa, non empregamos o método do estándar de referencia para determinar a porcentaxe de concordancia (positiva, negativa e global) e outros parámetros de comparación para as catro análises. Cada comparación de probas realizouse con CRS, neste estudo a CRS estableceuse pola regra "calquera positivo" e o resultado determinouse, non mediante unha única proba, empregamos polo menos dous resultados de probas coincidentes. Ademais, no caso da transmisión da COVID-19, os resultados falsos negativos son máis perigosos que os resultados falsos positivos. Polo tanto, para afirmar "positivo" da forma máis precisa posible a partir dun resultado de CRS, polo menos dúas probas de ensaio deben ser positivas, o que significa que é probable que polo menos un resultado positivo proceda dun ensaio EUA. Así, de catro resultados de probas, dous ou máis resultados de probas que dan o mesmo resultado considéranse verdadeiros positivos ou negativos18,27.
Os datos recolléronse mediante formularios estruturados de extracción de datos, a entrada e análise de datos realizouse co software estatístico Excel e SPSS versión 23.0 para as estatísticas descritivas. Analizouse a concordancia positiva, negativa e porcentual global, e utilizouse unha puntuación Kappa para determinar o grao de concordancia de cada método coa CRS. Os valores Kappa interprétanse do seguinte xeito: 0,01 a 0,20 para concordancia leve, 0,21 a 0,40 para concordancia xeral, 0,41-0,60 para concordancia moderada, 0,61-0,80 para concordancia maior e 0,81-0,99 para concordancia completa28.
Obtivose a autorización ética da Universidade de Addis Abeba e todos os protocolos experimentais para este estudo foron aprobados polo Consello de Revisión de Ética Científica do Instituto de Saúde Pública de Etiopía. O número de referencia da licenza ética da EPHI é EPHI/IRB-279-2020. Todos os métodos aplicáronse de acordo coas recomendacións e disposicións das Directrices Nacionais Integrais de Etiopía para o Tratamento da COVID-19. Ademais, obtívose o consentimento informado por escrito de todos os participantes no estudo antes da súa participación no estudo.
Todos os datos obtidos ou analizados neste estudo están incluídos neste artigo publicado. Os datos que respaldan os resultados deste estudo están dispoñibles a través do autor respectivo se se solicitan con razoable solicitude.
Organización Mundial da Saúde. Recomendacións para estratexias de probas de laboratorio para a COVID-19: orientación provisional, 21 de marzo de 2020 n.º OMS/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (OMS, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gourgoulianis, KI Diagnóstico intelixente da COVID-19 no servizo de urxencias: todo incluído na práctica. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gourgoulianis, KI Diagnóstico intelixente da COVID-19 no servizo de urxencias: todo incluído na práctica.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gurgulianis, KI Diagnóstico intelixente da COVID-19 no servizo de urxencias: todo na práctica.Muliou DS, Pantazopoulos I. e Gurgulyanis KI Diagnóstico intelixente da COVID-19 nos servizos de urxencias: integración integral na práctica. Expert Reverend Respire. medicine. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL e St George, K. Avaliación do ensaio COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL e St George, K. Avaliación do ensaio COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL e St. George, K. Avaliación do ensaio COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL e St. George K. Avaliación do ensaio COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
OMS. Detección en laboratorio da enfermidade por coronavirus 2019 (COVID-19) en casos sospeitosos de enfermidade humana. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (consultada o 15 de agosto de 2020) (OMS, 2020).
Udugama, B. et al. Diagnóstico da COVID-19: enfermidades e ferramentas de proba. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Creación do Colexio de Patólogos de África Oriental, Central e Meridional: Escola Rexional de Patoloxía de Oriente Medio e Sudáfrica. África. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Instituto Etíope de Saúde Pública, Ministerio Federal de Saúde. Estratexia e orientación nacionais provisionais para o diagnóstico de laboratorio da COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (consultada o 12 de agosto de 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. e Kesselheim, AS Probas falsas negativas para os desafíos e as implicacións da infección por SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. e Kesselheim, AS Probas falsas negativas para os desafíos e as implicacións da infección por SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim AS Probas falsos negativos para infeccións por SARS-CoV-2 e as súas consecuencias.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim AS Probas de falsos negativos para a provocación e o impacto da infección por SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS e Gourgoulianis, KI Casos de COVID-19 falsos positivos e falsos negativos: estratexias de prevención e xestión respiratoria, vacinación e outras perspectivas. Mouliou, DS e Gourgoulianis, KI Casos de COVID-19 falsos positivos e falsos negativos: estratexias de prevención e xestión respiratoria, vacinación e outras perspectivas. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная прострифи птротфи лечения, вакцинация e дальнейшие перспективы. Mouliou, DS e Gourgoulianis, KI Casos falsos positivos e falsos negativos de COVID-19: estratexias de prevención e tratamento respiratorio, vacinación e o camiño a seguir.Muliu, DS e Gurgulianis, KI Casos falsos positivos e falsos negativos de COVID-19: estratexias para a prevención e o tratamento respiratorio, a vacinación e o camiño a seguir. Expert Reverend Respire. medicine. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. e Konstantinos, G. Diagnóstico da COVID-19 no servizo de urxencias: ver a árbore pero perder o bosque. Mouliou, DS, Ioannis, P. e Konstantinos, G. Diagnóstico da COVID-19 no servizo de urxencias: ver a árbore pero perder o bosque.Mouliou, DS, Ioannis, P. e Konstantinos, G. Diagnóstico da COVID-19 no servizo de urxencias: vexa a árbore, perda o bosque.Muliou DS, Ioannis P. e Konstantinos G. Diagnóstico da COVID-19 nas salas de urxencias: non hai suficiente bosque para as árbores. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validación e validación do rendemento analítico e clínico do ensaio Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatoonian, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma da COVID-19 para a detección da infección por virus mediante RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatoonian, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma da COVID-19 para a detección da infección por virus mediante RT-PCR convencional.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatunyan, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma da COVID-19 para a detección de infección viral mediante RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatoonian, B. Comparación de 5 rexións xenéticas diferentes da COVID-19 para a detección de infección viral mediante RT-PCR convencional.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. e Aflatunyan B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma da COVID-19 para a detección de infección viral mediante RT-PCR convencional.Irán. J. Microbioloxía. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Resultados preliminares do programa nacional de avaliación externa da calidade para a detección de secuencias xenómicas do SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Avaliación analítica da eficacia de cinco kits de RT-PCR para a síndrome respiratoria aguda grave por coronavirus 2. J. Clinical. laboratory. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Avaliación de sete kits de detección de ARN do SARS-CoV-2 dispoñibles comercialmente na China baseados na reacción en cadea da polimerase (PCR) en tempo real. Clínico. Químico. Laboratorio. Medicina. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Comparación de sete kits comerciais de diagnóstico da COVID-19 por RT-PCR. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu e outros. Comparación do rendemento diagnóstico de dous kits de PCR para a detección de ácidos nucleicos do SARS-CoV-2. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. Un estudo comparativo de catro plataformas de probas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) do SARS-CoV-2 mostrou que o rendemento de ID NOW se degradaba significativamente dependendo do paciente e do tipo de mostra. diagnóstico. microbioloxía. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Molécula de Abbott. Prospecto da análise de SARS-CoV-2 en tempo real de Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (A 10 de agosto de 2020) (2020).
Klein, S. et al. Illamento de ARN do SARS-CoV-2 mediante esferas magnéticas para a detección rápida a grande escala mediante RT-qPCR e RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).