Rendemento de catro ensaios de amplificación do ácido nucleico para identificar SARS-Cov-2 en Etiopía

Grazas por visitar Nature.com. Está a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado. Para a mellor experiencia, recomendamos que use un navegador actualizado (ou desactivar o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir o apoio continuo, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez. Use os botóns anteriores e seguintes para moverse por tres diapositivas á vez ou use os botóns deslizantes ao final para moverse por tres diapositivas á vez.
Desde o brote de enfermidade de coronavirus de 2019 (COVID-19), moitas probas de amplificación de ácido nucleico comercial (NAATs) desenvolvéronse en todo o mundo e convertéronse en ensaios estándar. Aínda que varias probas foron desenvolvidas e aplicadas rapidamente a probas de diagnóstico de laboratorio, o rendemento destas probas non se avaliou nunha variedade de configuracións. Polo tanto, este estudo tiña como obxectivo avaliar o rendemento dos ensaios de Abbott SARS-Cov-2, DAAN, BGI e ensaios de biotecnoloxía SANSURE usando o estándar de referencia composto (CRS). O estudo realizouse no Instituto de Saúde Pública de Etiopía (EPHI) do 1 ao 30 de decembro de 2020. 164 As mostras nasofaríngicas foron extraídas usando o Kit Mini Kit de ARN QIAAMP e o sistema de preparación de mostras de ADN de Abbott. De 164 exemplares, o 59,1% foron positivos e o 40,9% foron negativos para CRS. A positividade da biotecnoloxía de sansure foi significativamente baixa en comparación con CRS (P <0.05). A positividade da biotecnoloxía de sansure foi significativamente baixa en comparación con CRS (P <0.05). Положительные результаты sansure biotech ыыли значительно ниже по сравнению с crs (p <0,05). Os resultados positivos de Sansure Biotech foron significativamente menores en comparación cos CRS (P <0.05).与 CRS 相比 ， sansure biotech 的阳性率显着较低 （p <0.05）。与 CRS 相比 ， sansure biotech 的阳性率显着较低 （p <0.05）。 A túa sansure biotech ыыло значительно менше положительных результатов по сранию с crs (p <0,05). Sansure Biotech tivo significativamente menos resultados positivos en comparación cos CRS (P <0.05).O acordo global das catro análises foi do 96,3-100% en comparación cos CRS. Ademais da baixa taxa de positividade do ensaio de biotecnoloxía SANSURE, o rendemento dos catro ensaios foi case comparable. Como tal, o ensaio Sansure Biotech [só de investigación (RUO)] require unha validación adicional para o seu uso en Etiopía. Finalmente, debería considerarse investigacións adicionais para avaliar os ensaios coas reclamacións do fabricante apropiadas.
As probas de laboratorio forman parte do plan estratéxico da Organización Mundial da Saúde (OMS) para a enfermidade de coronavirus 2019 (CovID-19) Preparación e resposta (SPRP). A quen aconsella que os países necesiten construír capacidade de laboratorio para mellorar a preparación, a xestión adecuada dos casos, a vixilancia e a resposta rápida aos retos da saúde pública. Isto suxire que o papel do laboratorio é clave para caracterizar a enfermidade e a epidemioloxía de axentes infecciosos emerxentes e controlar a súa propagación.
O diagnóstico de COVID-19 require información epidemiolóxica e médica, síntomas/signos persoais e datos radiográficos e de laboratorio2. Dado que se informou do brote Covid-19 en Wuhan, China, desenvolvéronse moitas probas de amplificación de ácido nucleico comercial (NAATs) en todo o mundo. A reacción en cadea da polimerase de transcrición inversa en tempo real (RRT-PCR) utilizouse como rutina e método estándar para o diagnóstico de laboratorio da síndrome respiratoria aguda grave 2 (SARS-CoV-2) 3 infección. A detección molecular de SARS-Cov-2 baséase normalmente no xene N (xene da proteína Nucleocápsida), E (xene da proteína envolvente) e xenes RDRP (xene ARN polimerase dependente do ARN) en ORF1A/B (marco de lectura aberta 1A/B). Xene) rexión identificada a partir do xenoma viral. Considéranse as principais rexións conservadas que se atopan nos xenomas virais para o recoñecemento de virus4. Entre estes xenes, os xenes RDRP e E teñen unha alta sensibilidade de detección analítica, mentres que o xen N ten baixa sensibilidade analítica5.
O rendemento dos ensaios de PCR pode variar dependendo de varios factores como: reactivos de extracción, reactivos de amplificación/detección, método de extracción, calidade da máquina PCR e outros instrumentos. En abril de 2020, máis de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nove países recibiron autorización de uso de emerxencia (EUA) para os diagnósticos CovID-196. En Etiopía, úsanse máis de 14 plataformas PCR en tempo real para a detección de PCR de SARS-CoV-2 en 26 institucións de saúde pública, incluíndo ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 e Quant-Studio7. Ademais, están dispoñibles varios kits de proba PCR, como a proba de xenes DAAN, a proba Abbott SARS-CoV-2, a proba de biotecnoloxía de sansure e a proba BGI SARS-CoV-2. Aínda que RRT-PCR é altamente sensible, algúns pacientes con covid-19 denuncian resultados negativos falsos debido a copias insuficientes do ácido ribonucleico viral (ARN) en mostras debido a unha colección inadecuada, transporte, almacenamento e manexo e probas de laboratorio. Condicións e accións do persoal8. Ademais, a manipulación de mostra ou control, configuración de limiar de ciclo (CT) e reactividade cruzada con outros ácidos nucleicos patóxenos ou ARN inactivo/residual SARS-Cov-2 pode levar a resultados falsos positivos en ensaios RRT-PCR9. Así, está claro que as probas de PCR poden realmente identificar transportistas de fragmentos de xenes, xa que nin sequera poden distinguir entre xenes virais realmente activos, polo que as probas só poden identificar transportistas e non pacientes10. Polo tanto, é importante avaliar o rendemento diagnóstico mediante métodos estándar na nosa configuración. Aínda que moitos reactivos NAAT están dispoñibles no Instituto de Saúde Pública de Etiopía (EPHI) e en todo o país, aínda non se informou de avaliación comparativa da súa eficacia. Polo tanto, este estudo tiña como obxectivo avaliar o rendemento comparativo de kits dispoñibles comercialmente para a detección de SARS-CoV-2 por RRT-PCR mediante exemplares clínicos.
Neste estudo incluíronse un total de 164 participantes con sospeitosos covid-19. A maioría das mostras procedían de centros de tratamento (118/164 = 72%), mentres que os restantes 46 (28%) participantes procedían de centros de non tratamento. Entre os participantes non tratados no centro, 15 (9,1%) tiveron casos sospeitosos clínicamente e 31 (18,9%) tiveron contactos de casos confirmados. Noventa e tres (56,7%) participantes foron masculinos, e a idade media (± SD) dos participantes foi de 31,10 (± 11,82) anos.
Neste estudo determináronse taxas positivas e negativas de catro probas para CovID-19. Así, as taxas positivas do ensaio Abbott SARS-CoV-2, o ensaio DAAN Gene 2019-NCOV, o ensaio BGI SARS-CoV-2 e o ensaio Sansure Biotech 2019-NCOV foron 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5% respectivamente. As puntuacións de normas de referencia compostas positivas e negativas (CRS) foron 97 (59,1%) e 67 (40,9%), respectivamente (táboa 1). Neste estudo, a definición de CRS baseouse na regra "calquera positiva", polo que de catro resultados das probas, dous ou máis resultados das probas que deron o mesmo resultado consideráronse positivos ou negativos verdadeiros.
Neste estudo, atopamos un acordo porcentual negativo (NPA) do 100% (95% CI 94,6-100) para todas as análises en comparación cos CRS. A análise de biotecnoloxía SANSURE mostrou un PPA mínimo do 93,8% (95% CI 87,2-97,1) e a análise DAAN Gene 2019-NCOV tivo un acordo global do 99,4% (95% CI 96,6-99,9). En contraste, o acordo global entre o ensaio BGI SARS-CoV-2 e o ensaio SANSURE BIOTech 2019-NCOV foi do 98,8% e do 96,3%, respectivamente (táboa 2).
O coeficiente de acordo Kappa de Cohen entre os resultados do ensaio CRS e Abbott SARS-CoV-2 foi totalmente consistente (K = 1,00). Do mesmo xeito, os valores de Kappa de Cohen detectados polo xene DAAN 2019-NCOV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-NCOV tamén son totalmente consistentes cos CRS (K ≥ 0,925). Nesta análise comparativa, a proba de chi-cadrado (proba MCNEMAR) demostrou que os resultados do ensaio SANSURE BIOTOCH 2019-NCOV foron significativamente diferentes dos resultados de CRS (P = 0,031) (táboa 2).
Como se mostra na fig.1 A porcentaxe do valor CT máis baixo (<20 ct) do ensaio Abbott Sars-Cov-2 (xene combinado RDRP e N) foi do 87,6% e o xene CT/B de ORF1A/B de SANSURE BIOTECH 2019-NCOV demostrou que o valor CT de baixo CT (<20 ct) foi de 36%. 1 A porcentaxe do valor CT máis baixo (<20 ct) do ensaio Abbott Sars-Cov-2 (xene combinado RDRP e N) foi do 87,6% e o xene CT/B de ORF1A/B de SANSURE BIOTECH 2019-NCOV demostrou que o valor CT de baixo CT (<20 ct) foi de 36%.Como se mostra na fig.1, процент наименшегео значения ct (<20 ct) анализа Abbott sars-cov-2 (коминированый генâ Rdrp и n) Orf1a/b анализа sansure biotech 2019-ncov показало что пцент низкого значения ct (<20 ct) составляime (36,3%, 36,4 ct) ct) ct) ct (36,3%ct) составля 2,2%. 1, a porcentaxe do valor CT máis baixo (<20 CT) da análise de Abbott Sars-Cov-2 (xene combinado RDRP e N) foi do 87,6%, e o valor CT de orf1a/b análise de xenes de sansure biotecnoloxía 2019-NCOV mostrou que a porcentaxe de baixo valor CT (<20 ct) contou por 50,3 ct (36 ct. 3,2%.如图 1 所示 ， Abbott sars-cov-2 检测 （结合 rdrp 和 n 基因） 的最低 ct 值百分比 （<20 ct） 为 87,6%， sansure biotech 2019-ncov 检测的 orf1a/b 基因 ct 值显示低 ct 值 (<20 ct) 的百分比为 50,3%高 高 高 高 高 ct 值显示低 (<20 ct) 的百分比为 高 高 高 高 高 高 高 高 ， ， ， ，的百分比为 3,2%。 Como se mostra na figura 1, a menor porcentaxe de valor CT (<20 ct) da proba de Abbott Sars-Cov-2 (combinación de xene RDRP e N) é do 87,6%, o valor orf1a/b do xene ct de sansure biotecnoloxía 2019-nCov mostra a porcentaxe baixa CT 值 (<20 ct) 的 的 高 ct). 3,2%. Как показано на р иу .... разере 87,6%, аначение ct гена orf1a/b в исследовании sansure biotech 2019- ааализ ncov пазал низкий ct. Como se mostra na figura 1, o ensaio Abbott SARS-CoV-2 (combinando os xenes RDRP e N) tiña o valor CT porcentual máis baixo (<20 CT) no 87,6%, mentres que o valor CT do xene ORF1A/B no estudo SANSure Biotech 2019-a análise de NCOV mostrou un TC baixo. Процент значений (<20 ct) составixe 50,3%, п процент ысоких значений ct (36–40 ct) составилira 3,2%. A porcentaxe de valores (<20 ct) foi do 50,3%e a porcentaxe de altos valores de TC (36-40 ct) foi do 3,2%.A proba de Abbott SARS-CoV-2 B rexistrou valores CT superiores a 30. Doutra banda, no ensaio BGI SARS-CoV-2 O xene ORF1A/B tiña unha porcentaxe de alto valor CT (> 36 CT) foi do 4% (Fig. 1). Doutra banda, no ensaio BGI SARS-CoV-2 O xene ORF1A/B tiña unha porcentaxe de alto valor CT (> 36 CT) foi do 4% (Fig. 1). С друeis с стороны, в ааализе bgi sars-cov-2 ген orf1a/b иел ысокое значение ct (> 36 ct), пцент котоrio. Por outra banda, na análise do xene BGI SARS-CoV-2 ORF1A/B tiña un alto valor CT (> 36 CT), cuxo porcentaxe foi do 4% (Fig. 1).另一方面 ， 在 bgi sars-cov-2 检测中 ， orf1a/b 基因具有高 ct 值 （> 36 ct） 的百分比为 4%（图 1）。 Por outra banda, na detección de BGI SARS-Cov-2, a porcentaxe de xene ORF1A/B con alto valor CT (> 36 CT) é do 4% (Figura 1). С друeis й стороны, в ааализе bgi Sars-cov-2 поцент генов orf1a/b с ысокимивизчениям ct (> 36 ct) сот 4% (р 1). Por outra banda, na análise BGI SARS-Cov-2, a porcentaxe de xenes ORF1A/B con valores altos de CT (> 36 CT) foi do 4% (Fig. 1).
Neste estudo, tomamos 164 mostras nasofaringeas. Para todo tipo de ensaios, o illamento de ARN e a amplificación realizouse empregando os métodos e kits recomendados polos respectivos fabricantes.
Este estudo demostrou que a proba de Abbott para SARS-Cov-2 ten o mesmo rendemento de detección que CRS, con concordancia 100% positiva, negativa e global. O acordo Kappa de Cohen é de 1,00, o que indica un acordo completo con CRS. Un estudo similar da Universidade de Washington en Estados Unidos descubriu que a sensibilidade e especificidade global da proba de Abbott para SARS-CoV-2 foi do 93% e do 100%, respectivamente, en comparación co ensayo de laboratorio determinado (LDA) do CDC. 11. O sistema de detección de Abbott SARS-CoV-2 baséase na detección combinada simultánea dos xenes N e RDRP, xa que os dous xenes son máis sensibles, minimizando os falsos negativos12. Un estudo en Viena, Austria tamén demostrou que os grandes volumes de mostra de extracción e os volumes dos eluentes de detección minimizaban os efectos de dilución e o aumento da eficiencia de detección13. Así, a coincidencia perfecta de Abbott para o ensaio SARS-CoV-2 pode asociarse a un sistema de detección de plataformas que detecta simultaneamente xenes combinatorios, extrae un gran número de mostras (0,5 ml) e usa unha gran cantidade de eluente (40 µL).
Os nosos resultados tamén demostraron que o rendemento de detección da proba xenética Daan foi case o mesmo que o dos CR. Isto é coherente cun estudo14 realizado na Universidade Anhui en Huainan, China e a reclamación do fabricante de acordo 100% positivo. A pesar dos informes de resultados consistentes, unha mostra foi falsa negativa despois de volver a probar o mesmo eluante, pero foi positivo nos ensaios Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech NCOV-2019. Isto suxire que pode haber variabilidade nos resultados en diferentes tipos de ensaios. Non obstante, no estudo realizado en China15, o resultado do ensaio do xene DAAN foi significativamente diferente (P <0.05) en comparación co seu ensaio de referencia definido por laboratorio. Non obstante, no estudo realizado en China15, o resultado do ensaio do xene DAAN foi significativamente diferente (P <0.05) en comparación co seu ensaio de referencia definido por laboratorio. Тем не менеanos, в иследованиии, прведенном к ки15, результат анализа Daan Gene значительнно тт gen gen (p <0.05) лабораторно: эталонного анализа. Non obstante, nun estudo en China15, o resultado da análise do xene DAAN foi significativamente diferente (P <0.05) da súa análise de referencia de laboratorio.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异 （p <0,05）。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако в исследовании, преденнanos в китае15, результаты генетического теста daan значите <тннно?о чччл id сравнению с еталонны лабораторны тестом. Non obstante, nun estudo en China15, os resultados da proba xenética de Daan foron significativamente diferentes (P <0.05) en comparación coa súa proba de laboratorio de referencia.Esta discrepancia pode deberse á sensibilidade da proba de referencia para detectar SARS-Cov-2, e os estudos posteriores poden ser importantes para determinar a causa.
Ademais, o noso estudo evaluou o rendemento comparativo do ensaio SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un acordo porcentual positivo excelente (PPA = 97,9%), acordo porcentual negativo (NPA = 100%) e acordo porcentual global por xénero (OPA). ). = 98,8%). Os valores de Kappa de Cohen mostraron un bo acordo (K = 0,975). Os estudos nos Países Baixos16 e China15 demostraron resultados consistentes. A proba de detección SARS-CoV-2 BGI é unha proba de detección de xene (ORF1A/B) (ORF1A/B) usando 10 µL de amplificación/detección eluante. A pesar dun bo acordo estatístico cos nosos resultados de referencia, a análise perdeu dúas mostras positivas (1,22%) da mostra total. Isto pode ter enormes implicacións clínicas para a dinámica de transmisión tanto no nivel do paciente como da comunidade.
Outra análise comparativa incluída neste estudo foi o ensayo RRT-PCR (RUO) Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (RUO); A porcentaxe global de partidos foi do 96,3%. A forza do acordo tamén foi determinada polo valor kappa de Cohen, que foi de 0,925, o que indica un acordo completo coa CRS. De novo, os nosos resultados son idénticos aos estudos realizados na Central South University en Changsha, China e no departamento de laboratorio clínico do Hospital Popular de Liuzhou, cidade de Liuzhou, China17. A pesar de que se rexistrou a boa concordancia estatística anterior, a proba de chi-cadrado (proba MACNEMAR) demostrou que o resultado do ensaio de biotecnoloxía SANSURE tivo unha diferenza estatisticamente significativa en comparación con CRS (P <0,005). A pesar de que se rexistrou a boa concordancia estatística anterior, a proba de chi-cadrado (proba MACNEMAR) demostrou que o resultado do ensaio de biotecnoloxía SANSURE tivo unha diferenza estatisticamente significativa en comparación con CRS (P <0,005). Несмотря н то, что ыыы зафиксировано eder уазанное ыше хороше статистическое сответветсетсетс iso (критерий макнема) показал, что рез Tesзтатanta а fasлensure sansure biotech имеет стастически ззимое р fas < 0,005). Aínda que se rexistrou o bo acordo estatístico anterior, a proba de chi-cadrado (proba MCNEMAR) demostrou que o resultado do ensaio de biotecnoloxía SANSURE tiña unha diferenza estatisticamente significativa en comparación co CRS (P <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验 （macnemar 检验） 表明 ， sansure biotech 检测的结果与 crs 相比具有统计学显着差异 （p <0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（（（Macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果 与 crs 相比 具有 显着 （（（p <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））））） Несмотря н отеченное ышыше хорее статистическое сооответствие, кийерий хи-кадраick (как (пз пх кк кк п) п fasм ххн кк к) ormл статистически значимую разниц Tes (p <0,005) межу ааализом sansure biotech и crs. A pesar do bo acordo estatístico mencionado anteriormente, a proba de chi-cadrado (proba MCNEMAR) mostrou unha diferenza estatisticamente significativa (P <0,005) entre o ensaio de biotecnoloxía SANSURE e o CRS.Atopáronse seis mostras (3,66%) como falsas negativas en comparación cos CR (táboa complementaria 1); Isto é moi importante, especialmente dada a dinámica da transmisión do virus. Os datos anteriores tamén admiten esta baixa taxa de detección15.
Neste estudo determináronse os valores de TC para cada ensaio e a plataforma respectiva, co valor CT medio máis baixo informado no ensaio Abbott SARS-CoV-2. Este resultado pode estar relacionado co sistema de probas xenéticas combinadas simultáneas de Abbott para a detección de SARS-Cov-2. Polo tanto, segundo a figura 1, o 87,6% dos resultados de Abbott SARS-Cov-2 tiñan valores de TC por baixo de 20. Só un pequeno número de resultados da mostra (12,4%) estaban no rango 20-30. Non se rexistraron valores de TC superiores a 30. Ademais do uso de Abbott do formato de proba xenética do panel SARS-CoV-2, este resultado pode estar relacionado co límite de detección inferior (32,5 copias de ARN/ml) 18, que é tres veces inferior ao límite inferior da compañía de 100 copias de ARN/ml. Ml) 19.
Este estudo ten algunhas limitacións: en primeiro lugar, non temos métodos estándar/de referencia [como a carga viral ou outras probas de laboratorio (LDA)] debido á falta de recursos. En segundo lugar, todos os exemplares empregados neste estudo foron tampóns nasofaringes, mentres que os resultados non foron aplicables a outros tipos de exemplares, e en terceiro lugar, o noso tamaño da mostra foi pequeno.
Este estudo comparou o rendemento de catro ensaios RRT-PCR para SARS-Cov-2 usando mostras nasofaringeas. Todos os ensaios de detección tiveron un rendemento case comparable, coa excepción do ensaio Biotech SANSURE. Ademais, identificouse a baixa taxa de positividade no ensaio de biotecnoloxía SANSURE en comparación co CRS (P <0.05). Ademais, identificouse a baixa taxa de positividade no ensaio de biotecnoloxía SANSURE en comparación co CRS (P <0.05). Кроме тог, в тесте sansure biotech ыы ввлен низкий поцент положительыхых рельтатâa положительных р р рº (p <0,05). Ademais, a proba de biotecnoloxía SANSURE mostrou unha baixa porcentaxe de resultados positivos en comparación cos CRS (P <0,05).此外 ， 与 crs 相比 ， sansure biotech 检测的阳性率较低 (p <0.05)。此外 ， 与 crs 相比 ， sansure biotech 检测的阳性率较低 (p <0.05)。 Кроме то vendedor, анализ sansure biotech имел более низкий уовень положительных резельтов olor со ооооыхых р Tes. Ademais, o ensaio de biotecnoloxía de sansure tivo unha taxa de positividade máis baixa en comparación coa CRS (P <0,05).A análise SANSURE BIOTech NCOV-2019 (RUO) de PPA, NPA e acordo global superou o 93,5% cun valor de cohen kappa de valor de acordo de 0,925. Finalmente, o ensayo de biotecnoloxía SANSURE (RUO) necesita unha validación adicional para o seu uso en Etiopía, e debería considerarse investigacións adicionais para avaliar as reclamacións de fabricantes individuais.
O deseño comparativo do estudo realizouse en catro instalacións sanitarias en Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treating Center, Zewooditu Hospital Memorial e Hospital especializado en tuberculose de San Pedro. Os datos foron recollidos entre o 1 e o 31 de decembro de 2020. As instalacións médicas para este estudo foron escollidas de forma intencionada en función do seu elevado número de casos e da dispoñibilidade de principais centros de tratamento da cidade. Do mesmo xeito, os instrumentos, incluídos os instrumentos de PCR en tempo real ABI 7500 e Abbott M2000, foron seleccionados segundo as recomendacións dos fabricantes de reactivos NAAT, e catro kits de detección de PCR foron seleccionados para este estudo, xa que a maioría dos laboratorios en Etiopía usaron polo menos catro deles. Proba de xenes, proba de Abbott SARS-CoV-2, proba de biotecnoloxía de sansure e proba BGI SARS-CoV-2 realizada durante o estudo).
As probas de SARS-Cov-2 realizáronse do 1 ao 30 de decembro de 2020 usando 3 ml de medio de transporte viral (VTM) (Tecnoloxía Miraclean, Shenzhen, China) de individuos investigados por covid-19 referidos a Ephi. As mostras nasofaríngicas foron recollidas por colectores de mostras adestradas e enviadas a EPHI en paquetes triples. Antes do illamento do ácido nucleico, a cada mostra atribúeselle un número de identificación único. A extracción realízase de cada mostra inmediatamente despois da chegada mediante métodos manuais e de extracción automática. Así, para a extracción automática de Abbott M2000, 1,3 ml (incluíndo 0,8 ml de volume morto e volume de entrada de extracción de 0,5 ml) da mostra foi extraída de cada mostra e pasou polo sistema de preparación de mostras de ADN de Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Un lote de 96 [92 mostras, dous controis de detección e dous controis non de plantilla (NTC)] incluíuse no proceso global (recuperación e detección) de dúas roldas de SARS-Cov-2 (EUA) en tempo real. minería. Do mesmo xeito, para a extracción manual, use as mesmas mostras (para a extracción automática e o descubrimento). Así, durante todo o proceso, 140 µl de mostras foron aliquotadas e extraídas usando o mini kit de ARN viral QIAAMP (Qiagen GmbH, Hilden, Alemaña) en lotes de 24 (incluíndo 20 mostras, dous controis de ensaio e dous NTCs) en nove roldas. Os eluatos extraídos manualmente foron amplificados e detectados mediante un ciclista térmico ABI 7500 mediante o ensaio BGI SARS-Cov-2, o ensaio de xenes DAAN e o ensaio de biotecnoloxía Sansure.
Illamento automatizado e purificación do ARN viral SARS-CoV-2 segue o principio de perla magnética usando reactivos de preparación de mostras de ADN de Abbott. A inactivación de mostras e a solubilización de partículas virais realízase mediante un deterxente que contén isotiocianato de guanidina para desnaturalizar a proteína e inactivar a RNase. O ARN é entón separado da proteína por separación de fase sólida mediante sílice, é dicir, a sal de guanidinio e o pH alcalino do tampón de lise promoven a unión dos ácidos nucleicos á sílice (SIO2). O paso de aclarado elimina as proteínas e os restos restantes para producir unha solución clara. O ARN transparente está illado de micropartículas a base de sílice usando o campo magnético do instrumento20,21. Por outra banda, o illamento manual e a purificación do ARN é realizado polo método de columna de xiro mediante centrifugación en lugar dun soporte magnético e separación de micropartículas do eluente.
A proba de detección de Abbott en tempo real SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) realizouse segundo as instrucións do fabricante, que recibiron EUA19,22 da OMS e da FDA. Neste protocolo, a inactivación da mostra antes da extracción realizouse nun baño de auga a 56 ° C durante 30 min. Despois da inactivación do virus, a extracción de ácido nucleico realizouse nun instrumento Abbott M2000 SP de 0,5 ml VTM usando un sistema de preparación de mostras de ADN Abbott M2000. Segundo o fabricante. A amplificación e a detección realizáronse mediante un instrumento Abbott M2000 RT-PCR e realizouse a detección dual para os xenes RDRP e N. Rox) e Vic P (colorante propietario) para orientar e detectar controis internos, permitindo a detección simultánea de ambos os produtos de amplificación 19.
O método de detección de amplificación deste kit baséase na tecnoloxía RT-PCR dun só paso. Os xenes ORF1A/B e N foron seleccionados como rexións conservadas pola tecnoloxía xénica DAAN para detectar a amplificación da rexión diana. Os cebadores específicos e as sondas fluorescentes (n sondas xénicas etiquetadas con sondas FAM, ORF1A/B etiquetadas con VIC) deseñáronse para detectar o ARN SARS-Cov-2 en mostras. Preparáronse as mesturas de eluentes e mestras finais engadindo 5 µL de eluente a 20 µL da mestura mestra a un volume final de 25 µL. A amplificación e a detección realizáronse simultaneamente nun instrumento PCR en tempo real ABI 750024.
Os xenes ORF1A/B e N detectáronse usando o kit de diagnóstico de ácido nucleico Biotech NCOV-2019 (detección de PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada xene obxectivo seleccionando a canle FAM para a rexión ORF1A/B e a canle ROX para o xene N. A este kit de ensaio, os reactivos de mestura eluente e mestre engádense do seguinte xeito: Prepare 30 µL de reactivo mestre mestre e 20 µL de mostra eluída para a súa detección/amplificación. A PCR en tempo real ABI 750025 utilizouse para a amplificación/detección.
A proba BGI SARS-CoV-2 é un fluorescente kit RRT-PCR en tempo real para o diagnóstico de CovID-19. A rexión obxectivo está situada na rexión ORF1A/B do xenoma SARS-Cov-2, que é un método único de detección de xenes. Ademais, o xene β-actina do mantemento humano é un xene regulado internamente. A mestura mestra prepárase mesturando 20 µL do reactivo mestre e 10 µL da mostra de ARN extraída nunha placa de pozo26. Para amplificar e detectar un instrumento de PCR cuantitativo fluorescente en tempo real ABI 7500. Todas as amplificacións de ácido nucleico, as condicións de execución de PCR para cada ensaio e a interpretación de resultados realizáronse segundo as instrucións do fabricante respectivo (táboa 3).
Nesta análise comparativa, non empregamos o método estándar de referencia para determinar o acordo por cento (positivo, negativo e en xeral) e outros parámetros de comparación para as catro análises. Cada comparación de probas fíxose con CRS, neste estudo o CRS foi establecido pola regra "calquera positivo" e o resultado foi determinado, non por unha única proba, empregamos polo menos dous resultados de proba correspondentes. Ademais, no caso da transmisión de Covid-19, os resultados negativos falsos son máis perigosos que os falsos resultados positivos. Polo tanto, dicir "positivo" coa maior precisión posible dun resultado de CRS, polo menos dúas probas de ensaio deben ser positivas, o que significa que polo menos un resultado positivo é probable que procedan dun ensaio da UEA. Así, de catro resultados das probas, dous ou máis resultados das probas que dan o mesmo resultado considéranse verdadeiros positivos ou negativos18,27.
Os datos foron recollidos mediante formularios de extracción de datos estruturados, a entrada de datos e a análise realizáronse mediante software estatístico Excel e SPSS versión 23.0 para estatísticas descritivas. Analizouse un acordo positivo, negativo e global por cento e utilizouse unha puntuación Kappa para determinar o grao de acordo de cada método con CRS. Os valores de Kappa interprétanse do seguinte xeito: 0,01 a 0,20 para un acordo leve, 0,21 a 0,40 para un acordo xeral, 0,41-0,60 para un acordo moderado, 0,61-0,80 para un acordo principal e 0,81-0,99 para un acordo completo28.
A depuración ética obtívose da Universidade de Addis Abeba e todos os protocolos experimentais para este estudo foron aprobados polo Consello de Revisión de Ética Científica do Instituto de Saúde Pública de Etiopía. O número de referencia para a licenza de ética EPHI é EPHI/IRB-279-2020. Todos os métodos aplicáronse de acordo coas recomendacións e disposicións das directrices internacionais de Etiopía para o tratamento de CovID-19. Ademais, obtívose o consentimento informado por escrito de todos os participantes no estudo antes da participación no estudo.
Todos os datos obtidos ou analizados neste estudo inclúense neste artigo publicado. Os datos que apoian os resultados deste estudo están dispoñibles do respectivo autor por unha solicitude razoable.
Organización Mundial da Saúde. Recomendacións para estratexias de proba de laboratorio para Covid-19: orientación provisional, 21 de marzo de 2020 Nº OMS/2019-NCOV/LAB_TESTING/2020.1 (OMS, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gourgoulianis, Ki Covid-19 Diagnóstico intelixente no departamento de emerxencias: All-in na práctica. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gourgoulianis, Ki Covid-19 Diagnóstico intelixente no departamento de emerxencias: All-in na práctica.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gurgulianis, Ki Diagnóstico intelixente de Covid-19 no departamento de emerxencias: Todo na práctica.Muliou DS, Pantazopoulos I. e Gurgulyanis Ki Diagnóstico intelixente de Covid-19 nos departamentos de emerxencia: integración de punta a punta na práctica. Reverendo Experto Respire. medicina. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Avaliación do ID COVID19 agora ensayo da EUA. Mitchell, SL & St George, K. Avaliación do ID COVID19 agora ensayo da EUA.Mitchell, SL e St. George, K. Avaliación do ensaio Covid19 ID agora.Mitchell SL e St. George K. Avaliación do ensaio Covid19 ID agora. J. Clínico. Virus. 128, 104429. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
OMS. Detección de laboratorio da enfermidade de coronavirus 2019 (CovID-19) na sospeita enfermidade humana. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (accedido o 15 de agosto de 2020) (OMS, 2020).
Udugama, B. et al. Diagnóstico CovID-19: enfermidades e ferramentas de proba. ACS Nano 14 (4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Establecemento do Colexio de Patólogos de Oriente, Central e Sur - Escola Rexional de Patoloxía de Oriente Medio e Sudáfrica. África. J. Lab. medicina. 9 (1), 1-8 (2020).
Instituto Etiopio de Saúde Pública, Ministerio Federal de Saúde. Estratexia nacional e orientación interina para o diagnóstico de laboratorio de CovID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/ephi_pheoc_covid-19_laboratory_diagnosis_eng.pdf (accedeu o 12 de agosto de 2020) (Ephi, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. e Kesselheim, como falsas probas negativas para retos e implicacións de infección por SARS-Cov-2. Woloshin, S., Patel, N. e Kesselheim, como falsas probas negativas para retos e implicacións de infección por SARS-Cov-2.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim como probas falsas-negativas para infeccións SARS-Cov-2 e as súas consecuencias.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim como probas falsas-negativas para a provocación e o impacto da infección por SARS-Cov-2. N. Eng. J. Medicina. 383 (6), E38 (2020).
Mouliou, DS e Gourgoulianis, Ki Casos de covid-19 falsos positivos e falsos-negativos: estratexias de prevención e xestión respiratorios, vacinación e máis perspectivas. Mouliou, DS e Gourgoulianis, Ki Casos de covid-19 falsos positivos e falsos-negativos: estratexias de prevención e xestión respiratorios, vacinación e máis perspectivas. Mouliou, ds & gourgoulianis, ki лжноположительные и и жнотрицательные случаи covid-19: респираторнаiros пофяяя и се] лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, Ki Falso positivo e falso casos negativos de Covid-19: Estratexias de prevención e tratamento respiratorios, vacinación e o camiño a seguir.Muliu, DS e Gurgulianis, Ki Casos falsos-positivos e falsos-negativos de Covid-19: Estratexias para a prevención e tratamento respiratorio, a vacinación e o camiño a seguir. Reverendo Experto Respire. medicina. 15 (8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19 diagnóstico no departamento de emerxencias: ver a árbore pero perder o bosque. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19 diagnóstico no departamento de emerxencias: ver a árbore pero perder o bosque.Mouliou, DS, Ioannis, P. e Konstantinos, G. Covid-19 diagnóstico no departamento de emerxencias: Vexa a árbore, perde o bosque.Muliou DS, Ioannis P., e Konstantinos G. Diagnóstico Covid-19 en salas de urxencia: non suficientes bosques para as árbores. Aparecer. medicina. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validación e validación do rendemento analítico e clínico do ensaio SARS-Cov-2 de Abbott. J. Clínico. Virus. 129, 104474. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-neneyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma de covid-19 para a detección de infección por virus por RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-neneyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de distintas rexións do xenoma de Covid-19 para a detección de infección por virus por RT-PCR convencional.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-neneyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatunyan, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de distintas rexións do xenoma Covid-19 para a detección de infección viral por RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-neneyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自 Covid-19 不同基因组区域的五个引物组 ， 用于通过常规 RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-neneyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Comparación de 5 rexións xenéticas diferentes de CovID-19 para a detección de infección viral por RT-PCR convencional.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neneyestanaki D, Fazlalipour M. e Aflatunyan B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de distintas rexións do xenoma Covid-19 para a detección de infección viral por RT-PCR convencional.Irán. J. Microbioloxía. 12 (3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Resultados preliminares do programa nacional de avaliación da calidade externa para a detección de secuencias do xenoma SARS-CoV-2. J. Clínico. Virus. 129, 104537. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Avaliación analítica da eficacia de cinco kits RT-PCR para o síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2. J. clínica. Laboratorio. ano. 35 (1), E23643 (2021).
Wang B. et al. Avaliación de sete kits de detección de ARN SARS-CoV-2 dispoñibles comercialmente en China baseados na reacción en cadea da polimerase en tempo real (PCR). Clínico. Químico. Laboratorio. medicina. 58 (9), E149 - E153 (2020).
Van Casteren, PB et al. Comparación de sete kits de diagnóstico COVID-PCR comerciais RT-PCR. J. Clínico. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Comparación do rendemento diagnóstico de dous kits PCR para a detección de ácidos nucleicos SARS-CoV-2. J. Clínico. Laboratorio. ano. 34 (10), E23554 (2020).
Lefart, PR, etc. Un estudo comparativo de catro plataformas de proba de amplificación de ácido nucleico SARS-CoV-2 (NAAT) demostrou que o rendemento ID agora se degradaba significativamente dependendo do tipo de paciente e mostra. diagnóstico. Microbioloxía. Infectar. dis. 99 (1), 115200 (2021).
Molécula de Abbott. Inserción de paquetes de análise SARS-CoV-2 de Abbott en tempo real. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/realtime-sars-cov-2-assay. 1-12. (A partir do 10 de agosto de 2020) (2020).
Klein, S. et al. Illamento de ARN SARS-CoV-2 usando perlas magnéticas para a detección rápida a gran escala mediante RT-QPCR e RT-LAMP. Virus 12 (8), 863 (2020).