Realización de catro ensaios de amplificación de ácidos nucleicos para identificar SARS-CoV-2 en Etiopía

Grazas por visitar Nature.com. Estás a usar unha versión do navegador con soporte CSS limitado. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos e JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez. Use os botóns Anterior e Seguinte para moverse por tres diapositivas á vez, ou use os botóns deslizantes ao final para moverse por tres diapositivas á vez.
Desde o brote da enfermidade de coronavirus (COVID-19) de 2019, moitas probas comerciais de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) desenvolvéronse en todo o mundo e convertéronse en ensaios estándar. Aínda que varias probas foron rapidamente desenvolvidas e aplicadas a probas de diagnóstico de laboratorio, o rendemento destas probas non se avaliou nunha variedade de escenarios. Polo tanto, este estudo tivo como obxectivo avaliar o rendemento dos ensaios Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech utilizando o Estándar de Referencia Composto (CRS). O estudo realizouse no Instituto Etíope de Saúde Pública (EPHI) do 1 ao 30 de decembro de 2020. Extraéronse 164 mostras nasofarínxeas mediante o mini kit de ARN QIAamp e o sistema de preparación de mostras de ADN de Abbott. De 164 exemplares, o 59,1% foron positivos e o 40,9% foron negativos para CRS. A positividade de Sansure Biotech foi significativamente baixa en comparación co CRS (p <0,05). A positividade de Sansure Biotech foi significativamente baixa en comparación co CRS (p <0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Os resultados positivos de Sansure Biotech foron significativamente inferiores en comparación co CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech tivo significativamente menos resultados positivos en comparación co CRS (p < 0,05).O acordo global das catro análises foi do 96,3 ao 100% en comparación co CRS. Ademais da baixa taxa de positividade do ensaio Sansure Biotech, o rendemento dos catro ensaios foi case comparable. Polo tanto, o ensaio Sansure Biotech [Research Only (RUO)] require unha validación adicional para o seu uso en Etiopía. Finalmente, débese considerar unha investigación adicional para avaliar os ensaios coas afirmacións adecuadas do fabricante.
As probas de laboratorio forman parte do Plan Estratéxico da Organización Mundial da Saúde (OMS) para a Preparación e Resposta á Enfermidade do Coronavirus 2019 (COVID-19). A OMS aconsella que os países teñan que construír a capacidade de laboratorio para mellorar a preparación, a xestión adecuada dos casos, a vixilancia e a resposta rápida aos desafíos de saúde pública. Isto suxire que o papel do laboratorio é clave para caracterizar a enfermidade e a epidemioloxía dos axentes infecciosos emerxentes e controlar a súa propagación.
O diagnóstico de COVID-19 require información epidemiolóxica e médica, síntomas/signos persoais e datos radiográficos e de laboratorio2. Desde que se informou do brote de COVID-19 en Wuhan, China, desenvolvéronse moitas probas comerciais de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) en todo o mundo. A reacción en cadea da polimerase de transcrición inversa en tempo real (rRT-PCR) utilizouse como método habitual e estándar para o diagnóstico de laboratorio da infección por síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2)3. A detección molecular do SARS-CoV-2 baséase normalmente nos xenes N (xene da proteína nucleocápsida), E (xene da proteína de envoltura) e RdRp (xene da ARN polimerase dependente do ARN) en ORF1a/b (marco de lectura aberto 1a/b) . xene) rexión identificada a partir do xenoma viral. Considérase que son as principais rexións conservadas que se atopan nos xenomas virais para o recoñecemento de virus4. Entre estes xenes, os xenes RdRp e E teñen unha alta sensibilidade de detección analítica, mentres que o xene N ten unha baixa sensibilidade analítica5.
O rendemento dos ensaios de PCR pode variar dependendo de varios factores, como: reactivos de extracción, reactivos de amplificación/detección, método de extracción, calidade da máquina de PCR e outros instrumentos. En abril de 2020, máis de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nove países recibiron a Autorización de uso de emerxencia (EUA) para diagnósticos de COVID-196. En Etiopía, utilízanse máis de 14 plataformas de PCR en tempo real para a detección por PCR de SARS-CoV-2 en 26 institucións de saúde pública, incluíndo ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7. Ademais, hai dispoñibles varios kits de proba de PCR, como a proba Daan Gene, a proba Abbott SARS-CoV-2, a proba Sansure Biotech e a proba SARS-CoV-2 BGI. Aínda que a rRT-PCR é moi sensible, algúns pacientes con COVID-19 informan de resultados falsos negativos debido á falta de copias de ácido ribonucleico viral (ARN) nas mostras debido á recollida, transporte, almacenamento e manipulación inadecuados e probas de laboratorio. condicións e actuacións do persoal8. Ademais, a manipulación incorrecta da mostra ou do control, a configuración do limiar do ciclo (Ct) e a reactividade cruzada con outros ácidos nucleicos patóxenos ou ARN SARS-CoV-2 inactivo/residual pode dar lugar a resultados falsos positivos nos ensaios rRT-PCR9. Así, está claro que as probas de PCR poden identificar portadores de fragmentos de xenes, xa que nin sequera poden distinguir entre xenes virais verdadeiramente activos, polo que as probas só poden identificar portadores e non pacientes10. Polo tanto, é importante avaliar o rendemento diagnóstico mediante métodos estándar no noso entorno. Aínda que moitos reactivos NAAT están dispoñibles no Instituto Etíope de Saúde Pública (EPHI) e en todo o país, aínda non se informou de ningunha avaliación comparativa da súa eficacia. Polo tanto, este estudo tivo como obxectivo avaliar o rendemento comparativo dos kits dispoñibles comercialmente para a detección de SARS-CoV-2 mediante rRT-PCR utilizando mostras clínicas.
Neste estudo incluíronse un total de 164 participantes con sospeita de COVID-19. A maioría das mostras eran de centros de tratamento (118/164 = 72%), mentres que os restantes 46 (28%) participantes eran de centros que non eran de tratamento. Entre os participantes non atendidos no centro, 15 (9,1%) tiñan casos clínicamente sospeitosos e 31 (18,9%) tiñan contactos de casos confirmados. Noventa e tres (56,7%) participantes eran homes e a idade media (± SD) dos participantes era de 31,10 (± 11,82) anos.
Neste estudo, determináronse as taxas positivas e negativas de catro probas para COVID-19. Así, as taxas positivas do ensaio Abbott SARS-CoV-2, o ensaio Daan Gene 2019-nCoV, o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foron do 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5% respectivamente. . As puntuacións positivas e negativas do estándar composto de referencia (CRS) foron 97 (59,1%) e 67 (40,9%), respectivamente (táboa 1). Neste estudo, a definición de CRS baseouse na regra de "calquera positivo", pola cal de catro resultados de proba, dous ou máis resultados de proba que deron o mesmo resultado consideráronse verdadeiramente positivos ou negativos.
Neste estudo, atopamos un acordo porcentual negativo (NPA) do 100% (IC 95% 94,6-100) para todas as análises en comparación co CRS. A análise de Sansure Biotechnology mostrou un PPA mínimo do 93,8% (IC do 95% 87,2-97,1) e a análise de Daan Gene 2019-nCoV tivo unha concordancia global do 99,4% (IC do 95% 96,6-99,9). Pola contra, o acordo global entre o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foi do 98,8% e do 96,3%, respectivamente (táboa 2).
O coeficiente de concordancia kappa de Cohen entre os resultados do ensaio CRS e Abbott SARS-CoV-2 foi totalmente consistente (K = 1,00). Do mesmo xeito, os valores kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV tamén son totalmente consistentes co CRS (K ≥ 0,925). Nesta análise comparativa, a proba de chi cadrado (proba McNemar) mostrou que os resultados do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV eran significativamente diferentes dos resultados do CRS (p = 0,031) (táboa 2).
Como se mostra na Fig.1, a porcentaxe do valor Ct máis baixo (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (xene RdRp e N combinado) foi do 87,6% e o valor Ct do xene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentaxe de baixo O valor de Ct (< 20 Ct) foi do 50,3% e o valor de Ct alto (36-40 Ct) foi do 3,2%. 1, a porcentaxe do valor Ct máis baixo (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (xene RdRp e N combinado) foi do 87,6% e o valor Ct do xene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentaxe de baixo O valor de Ct (< 20 Ct) foi do 50,3% e o valor de Ct alto (36-40 Ct) foi do 3,2%.Como se mostra na Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) 6си 8 и N) значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20%, лста) а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, a porcentaxe da análise do valor Ct máis baixo (< 20 Ct) de Abbott SARS-CoV-2 (xene combinado RdRp e N) foi do 87,6% e o valor Ct da análise do xene ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentaxe de baixo valor de Ct (< 20 Ct) representou o 50,3%, e de alto valor Ct (36-40 Ct) representaron o 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20%，San Biotech，876. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36)–40 Ct (36)–40 Ct的百分比为3,2%. Como se mostra na Figura 1, a porcentaxe máis baixa do valor Ct (< 20 Ct) da proba Abbott SARS-CoV-2 (combinación do xene RdRp e N) é do 87,6%, o valor Ct do xene ORF1a/b da proba Sansure Biotech 2019-nCoV. mostra unha porcentaxe baixa de Ct值(< 20 Ct) 的 é do 50,3%, A porcentaxe de 高Ct 值(36–40 Ct) 的 é do 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) como non hai máis Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV покат.зка Como se mostra na Figura 1, o ensaio Abbott SARS-CoV-2 (que combina os xenes RdRp e N) tivo o valor Ct porcentual máis baixo (< 20 Ct) nun 87,6%, mentres que o valor Ct do xene ORF1a/b no Sansure Estudo Biotech 2019: a análise do nCoV mostrou un Ct baixo. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 2%. A porcentaxe de valores (< 20 Ct) foi do 50,3% e a porcentaxe de valores altos de Ct (36-40 Ct) foi do 3,2%.A proba de Abbott SARS-CoV-2 B rexistrou valores de Ct superiores a 30. Por outra banda, no ensaio BGI SARS-CoV-2 o xene ORF1a/b tiña un alto valor de Ct (> 36 Ct) a porcentaxe era do 4% (Fig. 1). Por outra banda, no ensaio BGI SARS-CoV-2 o xene ORF1a/b tiña un alto valor de Ct (> 36 Ct) a porcentaxe era do 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент котол 4% (páxina 1). Por outra banda, na análise do BGI SARS-CoV-2 o xene ORF1a/b tivo un valor Ct elevado (> 36 Ct), cuxa porcentaxe foi do 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比一分比伈帀4% Por outra banda, na detección de BGI SARS-CoV-2, a porcentaxe de xene ORF1a/b cun alto valor de Ct (>36 Ct) é do 4% (Figura 1). Non é posible que o SARS-CoV-2 de BGI non se engade de ORF1a/b e que non ten datos de Ct (>36 Ct) сос 1% (>36 Ct). Por outra banda, na análise BGI SARS-CoV-2, a porcentaxe de xenes ORF1a/b con altos valores de Ct (>36 Ct) foi do 4% (Fig. 1).
Neste estudo, tomamos 164 mostras nasofarínxeas. Para todo tipo de ensaios, realizouse o illamento e amplificación de ARN mediante os métodos e kits recomendados polos respectivos fabricantes.
Este estudo demostrou que a proba de Abbott para SARS-CoV-2 ten o mesmo rendemento de detección que CRS, cunha concordancia 100% positiva, negativa e global. O acordo kappa de Cohen é de 1,00, o que indica un acordo total con CRS. Un estudo similar da Universidade de Washington en Estados Unidos descubriu que a sensibilidade e especificidade xeral da proba de Abbott para SARS-CoV-2 foi do 93% e do 100%, respectivamente, en comparación co ensaio determinado polo laboratorio (LDA) dos CDC. . 11. O sistema de detección de Abbott SARS-CoV-2 baséase na detección combinada simultánea dos xenes N e RdRp, xa que ambos xenes son máis sensibles, minimizando os falsos negativos12. Un estudo realizado en Viena, Austria tamén demostrou que os grandes volumes de mostras de extracción e volumes de eluentes de detección minimizaban os efectos de dilución e aumentaban a eficiencia da detección13. Así, a combinación perfecta de Abbott para o ensaio SARS-CoV-2 pode asociarse a un sistema de detección de plataforma que detecta simultaneamente xenes combinatorios, extrae un gran número de mostras (0,5 ml) e utiliza unha gran cantidade de eluyente (40 µl).
Os nosos resultados tamén mostraron que o rendemento de detección da proba xenética de Daan era case o mesmo que o do CRS. Isto é consistente cun estudo14 realizado na Universidade de Anhui en Huainan, China, e a afirmación do fabricante de acordo 100% positivo. A pesar dos informes de resultados consistentes, unha mostra foi falsamente negativa despois de volver a probar o mesmo eluato, pero resultou positiva nos ensaios de Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019. Isto suxire que pode haber variabilidade nos resultados en diferentes tipos de ensaios. Non obstante, no estudo realizado en China15, o resultado do ensaio do xene Daan foi significativamente diferente (p < 0,05) en comparación co seu ensaio de referencia definido no laboratorio. Non obstante, no estudo realizado en China15, o resultado do ensaio do xene Daan foi significativamente diferente (p < 0,05) en comparación co seu ensaio de referencia definido no laboratorio. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителедовании (5) их лабораторного эталонного анализа. Non obstante, nun estudo realizado en China15, o resultado da análise de Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) da súa análise de referencia de laboratorio.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значителоp < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Non obstante, nun estudo realizado en China15, os resultados da proba xenética de Daan foron significativamente diferentes (p < 0,05) en comparación coa súa proba de laboratorio de referencia.Esta discrepancia pode deberse á sensibilidade da proba de referencia para detectar SARS-CoV-2, e poden ser importantes estudos posteriores para determinar a causa.
Ademais, o noso estudo avaliou o rendemento comparativo do ensaio SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un excelente acordo porcentual positivo (PPA = 97,9 %), un acordo porcentual negativo (NPA = 100 %) e un acordo porcentual global por sexo. OPA). ). = 98,8%). Os valores de Kappa de Cohen mostraron un bo acordo (K = 0,975). Estudos en Holanda16 e China15 mostraron resultados consistentes. A proba SARS-CoV-2 BGI é unha proba de detección dun só xene (ORF1a/b) que utiliza 10 µl de eluido de amplificación/detección. A pesar da boa concordancia estatística cos nosos resultados de referencia, a análise perdeu dúas mostras positivas (1,22%) da mostra total. Isto pode ter enormes implicacións clínicas para a dinámica de transmisión tanto a nivel do paciente como da comunidade.
Outra análise comparativa incluída neste estudo foi o ensaio Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); a porcentaxe global de partida foi do 96,3%. A forza do acordo tamén estivo determinada polo valor Kappa de Cohen, que foi de 0,925, o que indica un acordo total co CRS. De novo, os nosos resultados son idénticos aos estudos realizados na Universidade Central do Sur en Changsha, China, e no Departamento de Laboratorio Clínico do Hospital Popular de Liuzhou, na cidade de Liuzhou, China17. Aínda que se rexistrou a boa concordancia estatística anterior, a proba de chi cadrado (proba MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech tivo unha diferenza estatisticamente significativa en comparación co CRS (p < 0,005). Aínda que se rexistrou a boa concordancia estatística anterior, a proba de chi cadrado (proba MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech tivo unha diferenza estatisticamente significativa en comparación co CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соотировано сототвере,тий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистичесри злески злесча зальтат по сравнению с CRS (p < 0,005). Aínda que se rexistrou o bo acordo estatístico anterior, a proba de chi cadrado (proba McNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech tiña unha diferenza estatisticamente significativa en comparación co CRS (p < 0,005).Sansure Biotech相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， biotech 滓与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。＼。。）） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий хи-квадратрат) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech e CRS. A pesar do bo acordo estatístico sinalado anteriormente, a proba de chi cadrado (proba McNemar) mostrou unha diferenza estatisticamente significativa (p < 0,005) entre o ensaio Sansure Biotech e o CRS.Atopáronse seis mostras (3,66%) falsas en comparación co CRS (táboa complementaria 1); isto é moi importante, sobre todo tendo en conta a dinámica de transmisión do virus. Os datos anteriores tamén admiten esta baixa taxa de detección15.
Neste estudo, determináronse os valores de Ct para cada ensaio e plataforma respectiva, co valor Ct medio máis baixo informado no ensaio Abbott SARS-CoV-2. Este resultado pode estar relacionado co sistema de proba xenética combinada simultánea de Abbott para a detección de SARS-CoV-2. Polo tanto, segundo a Figura 1, o 87,6% dos resultados de Abbott SARS-CoV-2 tiñan valores de Ct inferiores a 20. Só un pequeno número de resultados da mostra (12,4%) estaban no intervalo 20-30. Non se rexistraron valores de Ct superiores a 30. Ademais do uso por parte de Abbott do formato de proba xenética do panel SARS-CoV-2, este resultado pode estar relacionado co límite inferior de detección (32,5 copias de ARN/ml)18, que é tres veces inferior ao límite inferior da compañía de 100 copias de ARN. /ml. ml) 19.
Este estudo ten algunhas limitacións: en primeiro lugar, non dispoñemos de métodos estándar/de referencia [como a carga viral ou outras probas de laboratorio (LDA)] por falta de recursos. En segundo lugar, todos os exemplares utilizados neste estudo foron hisopos nasofarínxeos, mentres que os resultados non eran aplicables a outros tipos de mostras e, en terceiro lugar, o tamaño da nosa mostra era pequeno.
Este estudo comparou o rendemento de catro ensaios rRT-PCR para SARS-CoV-2 utilizando mostras nasofarínxeas. Todos os ensaios de detección tiveron un rendemento case comparable, a excepción do ensaio Sansure Biotech. Ademais, a baixa taxa de positividade identificouse no ensaio Sansure Biotech en comparación co CRS (p < 0,05). Ademais, a baixa taxa de positividade identificouse no ensaio Sansure Biotech en comparación co CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнс, 5 (CRS, 5). Ademais, a proba de Sansure Biotech mostrou unha baixa porcentaxe de resultados positivos en comparación co CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по срав не, CRS5 (CRS5). Ademais, o ensaio Sansure Biotech tivo unha taxa de positividade máis baixa en comparación co CRS (p < 0,05).A análise de Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA e acordo global superou o 93,5% cun valor de acordo de Cohen Kappa de 0,925. Finalmente, o Ensaio Biotecnolóxico Sansure (RUO) necesita unha validación adicional para o seu uso en Etiopía, e debe considerarse investigación adicional para avaliar as afirmacións dos fabricantes individuais.
O deseño do estudo comparativo realizouse en catro centros de saúde de Addis Abeba, o hospital Eka Kotebe, o centro de tratamento da Igrexa Millennium, o hospital Zewooditu Memorial e o hospital especializado en tuberculose de San Pedro. Os datos recompiláronse entre o 1 e o 31 de decembro de 2020. As instalacións médicas para este estudo elixíronse deliberadamente en función do seu elevado número de casos e da dispoñibilidade dos principais centros de tratamento da cidade. Do mesmo xeito, seleccionáronse instrumentos, incluídos os instrumentos de PCR en tempo real ABI 7500 e Abbott m2000, segundo as recomendacións dos fabricantes de reactivos NAAT, e seleccionáronse catro kits de detección de PCR para este estudo, xa que a maioría dos laboratorios de Etiopía utilizaron polo menos catro deles. Proba xenética, proba Abbott SARS-CoV-2, proba Sansure Biotech e proba SARS-CoV-2 BGI realizada durante o estudo).
As probas de SARS-CoV-2 realizáronse do 1 ao 30 de decembro de 2020 utilizando 3 ml de medio de transporte viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de individuos investigados por COVID-19 referidos a EPHI. As mostras nasofarínxeas foron recollidas por colectores de mostras adestrados e enviadas a EPHI en paquetes triples. Antes do illamento do ácido nucleico, a cada mostra asígnaselle un número de identificación único. A extracción de cada mostra realízase inmediatamente despois da chegada mediante métodos de extracción manual e automático. Así, para a extracción automática de Abbott m2000, extraéronse 1,3 ml (incluíndo 0,8 ml de volume morto e 0,5 ml de volume de entrada de extracción) da mostra de cada mostra e pasouse polo sistema de preparación de mostras de ADN de Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EUA). ) Incluíuse un lote de 96 [92 mostras, dous controis de detección e dous controis sen modelo (NTC)] no proceso global (recuperación e detección) de dúas roldas de SARS-CoV-2 (EUA) en tempo real. minería. Do mesmo xeito, para a extracción manual, use as mesmas mostras (para a extracción e descubrimento automáticos). Así, durante todo o proceso, 140 µl de mostras foron alícuotas e extraídas usando o QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemaña) en lotes de 24 (incluíndo 20 mostras, dous controis de ensaio e dous NTC) durante nove roldas. Os eluatos extraídos manualmente amplificáronse e detectáronse mediante un termociclador ABI 7500 mediante o ensaio SARS-CoV-2 BGI, o ensaio Daan Gene e o ensaio Sansure Biotech.
O illamento e purificación automatizados do ARN viral do SARS-CoV-2 seguen o principio de perlas magnéticas utilizando reactivos de preparación de mostras de ADN de Abbott. A inactivación das mostras e a solubilización das partículas virais realízase mediante un deterxente que contén isotiocianato de guanidina para desnaturalizar a proteína e inactivar a RNase. Despois, o ARN sepárase da proteína mediante a separación en fase sólida utilizando sílice, é dicir, o sal de guanidinio e o pH alcalino do tampón de lise promoven a unión dos ácidos nucleicos á sílice (SiO2). O paso de aclarado elimina as proteínas e os restos restantes para producir unha solución clara. O ARN transparente está illado de micropartículas a base de sílice utilizando o campo magnético do instrumento20,21. Por outra banda, o illamento manual e a purificación do ARN realízase mediante o método de columna de spin mediante centrifugación en lugar dun soporte magnético e separación das micropartículas do eluyente.
A proba de detección de SARS-CoV-2 en tempo real de Abbott (Abbott Molecular, Inc.) realizouse segundo as instrucións do fabricante, que recibiu EUA19,22 da OMS e da FDA. Neste protocolo, a inactivación da mostra antes da extracción realizouse nun baño de auga a 56 °C durante 30 min. Despois da inactivación do virus, realizouse a extracción de ácido nucleico nun instrumento Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM utilizando un sistema de preparación de mostras de ADN Abbott m2000. segundo o fabricante. A amplificación e detección realizáronse mediante un instrumento RT-PCR Abbott m2000 e realizouse a detección dual para os xenes RdRp e N. ROX) e VIC P (colorante propietario) para a orientación e detección de controis internos, permitindo a detección simultánea de ambos os produtos de amplificación 19 .
O método de detección de amplificación deste kit baséase na tecnoloxía RT-PCR dun paso. Os xenes ORF1a/b e N foron seleccionados como rexións conservadas pola Daan Gene Technology para detectar a amplificación da rexión diana. Deseñáronse cebadores específicos e sondas fluorescentes (sondas do xene N marcadas con FAM, sondas ORF1a/b marcadas con VIC) para detectar o ARN do SARS-CoV-2 nas mostras. O eluyente final e as mesturas mestra preparáronse engadindo 5 µl de eluyente a 20 µl da mestura principal ata un volume final de 25 µl. A amplificación e a detección realizáronse simultáneamente nun instrumento de PCR en tempo real ABI 750024.
Os xenes ORF1a/b e N detectáronse mediante o kit de diagnóstico de ácidos nucleicos nCoV-2019 de Sansure Biotech (detección por PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada xene diana seleccionando a canle FAM para a rexión ORF1a/b e a canle ROX para o xene N. A este kit de ensaio, engádense o eluyente e os reactivos da mestura principal do seguinte xeito: prepare 30 µl de reactivo da mestura principal e 20 µl de mostra eluída para a súa detección/amplificación. Utilizouse PCR en tempo real ABI 750025 para a amplificación/detección.
A proba SARS-CoV-2 BGI é un kit fluorescente de rRT-PCR en tempo real para o diagnóstico de COVID-19. A rexión diana está situada na rexión ORF1a/b do xenoma SARS-CoV-2, que é un método de detección dun só xene. Ademais, a β-actina do xene doméstico humano é un xene diana regulado internamente. A mestura mestra prepárase mesturando 20 µl do reactivo da mestura mestra e 10 µl da mostra de ARN extraída nunha placa de pozos26. Utilizouse un instrumento de PCR cuantitativo en tempo real fluorescente ABI 7500 para a amplificación e detección. Toda a amplificación de ácidos nucleicos, as condicións de execución da PCR para cada ensaio e a interpretación dos resultados realizáronse segundo as instrucións do fabricante respectivo (táboa 3).
Nesta análise comparativa, non utilizamos o método estándar de referencia para determinar a porcentaxe de acordo (positivo, negativo e global) e outros parámetros de comparación para as catro análises. Cada comparación de probas fíxose con CRS, neste estudo o CRS foi establecido pola regra "calquera positivo" e o resultado determinouse, non por unha única proba, usamos polo menos dous resultados de proba coincidentes. Ademais, no caso da transmisión da COVID-19, os resultados falsos negativos son máis perigosos que os falsos positivos. Polo tanto, para dicir "positivo" coa maior precisión posible a partir dun resultado CRS, polo menos dúas probas de ensaio deben ser positivas, o que significa que é probable que polo menos un resultado positivo proceda dun ensaio EUA. Así, de catro resultados das probas, dous ou máis resultados das probas que dan o mesmo resultado considéranse verdadeiros positivos ou negativos18,27.
Os datos recolléronse mediante formularios de extracción de datos estruturados, a entrada e análise de datos realizáronse mediante o software estatístico Excel e SPSS versión 23.0 para estatísticas descritivas. Analizáronse as porcentaxes de acordo positivo, negativo e global e utilizouse unha puntuación Kappa para determinar o grao de concordancia de cada método co CRS. Os valores Kappa interprétanse do seguinte xeito: 0,01 a 0,20 para acordo leve, 0,21 a 0,40 para acordo xeral, 0,41-0,60 para acordo moderado, 0,61-0,80 para acordo maior e 0,81-0,99 para acordo completo28.
Obtívose a autorización ética da Universidade de Addis Abeba e todos os protocolos experimentais para este estudo foron aprobados pola Xunta de Revisión de Ética Científica do Instituto Etíope de Saúde Pública. O número de referencia para a Licenza de Ética EPHI é EPHI/IRB-279-2020. Todos os métodos aplicáronse de acordo coas recomendacións e disposicións das Directrices Integrais Nacionais de Etiopía para o tratamento da COVID-19. Ademais, obtívose o consentimento informado por escrito de todos os participantes do estudo antes da participación no estudo.
Todos os datos obtidos ou analizados neste estudo inclúense neste artigo publicado. Os datos que apoian os resultados deste estudo están dispoñibles do autor respectivo previa solicitude razoable.
Organización Mundial da Saúde. Recomendacións para as estratexias de probas de laboratorio para a COVID-19: Orientación provisional, 21 de marzo de 2020 No. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (OMS, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Diagnóstico intelixente COVID-19 no Departamento de Emerxencias: todo en práctica. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Diagnóstico intelixente COVID-19 no Departamento de Emerxencias: todo en práctica.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gurgulianis, KI Diagnóstico intelixente de COVID-19 no servizo de urxencias: todo na práctica.Muliou DS, Pantazopoulos I. e Gurgulyanis KI Diagnóstico intelixente de COVID-19 nos servizos de emerxencia: integración de extremo a extremo na práctica. Experto Reverendo Respire. medicina. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL e St George, K. Avaliación do ensaio EUA ID COVID19 NOW. Mitchell, SL e St George, K. Avaliación do ensaio EUA ID COVID19 NOW.Mitchell, SL e St. George, K. Evaluation of the COVID19 ID NOW EUA assay.Mitchell SL e St. George K. Avaliación do ensaio COVID19 ID NOW EUA. J. Clínica. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
OMS. Detección de laboratorio da enfermidade por coronavirus 2019 (COVID-19) en sospeita de enfermidade humana. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (consultado o 15 de agosto de 2020) (OMS, 2020).
Udugama, B. et al. Diagnóstico de COVID-19: enfermidades e ferramentas de proba. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Establecemento do Colexio de Patólogos de África Oriental, Central e Meridional - Escola Rexional de Patoloxía de Oriente Medio e Sudáfrica. África. J. Laboratorio. medicina. 9(1), 1-8 (2020).
Instituto Etíope de Saúde Pública, Ministerio Federal de Saúde. Estratexia e orientación nacional provisional para o diagnóstico de laboratorio da COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (consultado o 12 de agosto de 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. e Kesselheim, AS Probas de falsos negativos para os retos e implicacións da infección por SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. e Kesselheim, AS Probas de falsos negativos para os retos e implicacións da infección por SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim AS Probas de falsos negativos para infeccións por SARS-CoV-2 e as súas consecuencias.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim AS Probas de falsos negativos para a provocación e o impacto da infección por SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicina. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casos de COVID-19 falsos positivos e falsos negativos: estratexias de prevención e xestión respiratoria, vacinación e outras perspectivas. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casos de COVID-19 falsos positivos e falsos negativos: estratexias de prevención e xestión respiratoria, vacinación e outras perspectivas. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная прострифи птротфи лечения, вакцинация e дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casos falsos positivos e falsos negativos de COVID-19: estratexias de prevención e tratamento respiratorio, vacinación e camiño a seguir.Muliu, DS e Gurgulianis, KI Casos falsos positivos e falsos negativos de COVID-19: estratexias de prevención e tratamento respiratorio, vacinación e camiño a seguir. Experto Reverendo Respire. medicina. 15 (8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnóstico de COVID-19 no departamento de emerxencias: ver a árbore pero perder o bosque. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnóstico de COVID-19 no departamento de emerxencias: ver a árbore pero perder o bosque.Mouliou, DS, Ioannis, P. e Konstantinos, G. Diagnosis COVID-19 in the Emergency Department: See the Tree, Lose the Forest.Muliou DS, Ioannis P. e Konstantinos G. Diagnosis COVID-19 in Emergency Rooms: Not Enough Forest for the Trees. Aparece. medicina. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validación e validación do rendemento analítico e clínico do ensaio Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clínica. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma de COVID-19 para a detección da infección por virus mediante RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma de COVID-19 para a detección da infección por virus mediante RT-PCR convencional.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatunyan, B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma COVID-19 para a detección da infección viral mediante RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Comparación de 5 rexións xenéticas diferentes de COVID-19 para a detección de infección viral mediante RT-PCR convencional.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. e Aflatunyan B. Comparación de cinco conxuntos de cebadores de diferentes rexións do xenoma COVID-19 para a detección da infección viral mediante RT-PCR convencional.Irán. J. Microbioloxía. 12 (3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Resultados preliminares do programa nacional de avaliación da calidade externa para a detección de secuencias do xenoma do SARS-CoV-2. J. Clínica. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Avaliación analítica da eficacia de cinco kits de RT-PCR para a síndrome respiratoria aguda grave Coronavirus 2. J. Clinical. laboratorio. ano. 35 (1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Avaliación de sete kits de detección de ARN SARS-CoV-2 dispoñibles comercialmente en China baseados na reacción en cadea da polimerase (PCR) en tempo real. clínica. Química. laboratorio. medicina. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Comparación de sete kits de diagnóstico RT-PCR COVID-19 comerciais. J. Clínica. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Comparación do rendemento diagnóstico de dous kits de PCR para a detección de ácidos nucleicos SARS-CoV-2. J. Clínica. laboratorio. ano. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. Un estudo comparativo de catro plataformas de probas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) SARS-CoV-2 mostrou que o rendemento de ID NOW deteriorouse significativamente dependendo do paciente e do tipo de mostra. diagnóstico. microbioloxía. Infectar. diss. 99 (1), 115200 (2021).
Molécula de Abbott. Folleto de análise do SARS-CoV-2 de Abbott en tempo real. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (A partir do 10 de agosto de 2020) (2020).
Klein, S. et al. Illamento de ARN de SARS-CoV-2 mediante esferas magnéticas para unha detección rápida a gran escala mediante RT-qPCR e RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).