Factores de interferencia nas reaccións de PCR

Durante a reacción de PCR, a miúdo atópanse algúns factores interferentes.
Debido á moi alta sensibilidade da PCR, a contaminación considérase un dos factores máis importantes que afectan os resultados da PCR e pode producir resultados falsos positivos.
Igualmente críticas son as diversas fontes que conducen a resultados falsos negativos. Se unha ou máis partes esenciais da mestura de PCR ou a propia reacción de amplificación se inhiben ou interfiren, o ensaio diagnóstico pode verse obstaculizado. Isto pode levar a unha eficiencia reducida e mesmo a resultados falsos negativos.
Ademais da inhibición, pode producirse a perda da integridade do ácido nucleico diana debido ás condicións de envío e/ou almacenamento antes da preparación da mostra. En particular, as altas temperaturas ou o almacenamento inadecuado poden provocar danos nas células e nos ácidos nucleicos. A fixación de células e tecidos e a incorporación de parafina son causas ben coñecidas da fragmentación do ADN e un problema persistente (ver Figuras 1 e 2). Nestes casos, incluso o illamento e purificación óptimos non axudarán.

Figura 1 | Efecto da inmobilización na integridade do ADN
A electroforese en xel de agarosa mostrou que a calidade do ADN illado de seccións de parafina das autopsias variou considerablemente. ADN de diferentes lonxitudes de fragmentos medias estivo presente nos extractos dependendo do método de fixación. O ADN conservouse só cando se fixou en mostras conxeladas nativas e en formalina neutra tamponada. O uso dun fixador de Bouin fortemente ácido ou formalina que contén ácido fórmico sen tampón provocou unha perda significativa de ADN. A fracción restante está moi fragmentada.
Á esquerda, a lonxitude dos fragmentos exprésase en pares de quilobases (kbp)

Figura 2 | Perda da integridade das dianas de ácidos nucleicos
(a) Unha brecha de 3′-5′ en ambas as febras producirá unha rotura no ADN diana. a síntese de ADN aínda ocorrerá no fragmento pequeno. Non obstante, se falta un sitio de recocido do cebador no fragmento de ADN, só se produce a amplificación lineal. No caso máis favorable, os fragmentos poden resaturarse entre si, pero os rendementos serán pequenos e por debaixo dos niveis de detección.
(b) A perda de bases, debido principalmente á depurinación e á formación de dímeros de timidina, leva a unha diminución do número de enlaces H e unha diminución da Tm. Durante a fase de quentamento alongada, os cebadores fundiranse do ADN da matriz e non se recocirán mesmo en condicións menos rigorosas.
(c) As bases de timina adxacentes forman un dímero TT.
Outro problema común que adoita ocorrer no diagnóstico molecular é a liberación menos que óptima de ácidos nucleicos diana en comparación coa extracción con fenol-cloroformo. En casos extremos, isto pode asociarse con falsos negativos. Pódese aforrar moito tempo coa lise fervendo ou a dixestión enzimática dos restos celulares, pero este método adoita producir unha baixa sensibilidade da PCR debido á liberación insuficiente de ácido nucleico.

Inhibición da actividade da polimerase durante a amplificación

En xeral, a inhibición úsase como concepto de recipiente para describir todos os factores que conducen a resultados de PCR subóptimos. Nun sentido estritamente bioquímico, a inhibición limítase á actividade do encima, é dicir, reduce ou impide a conversión de substrato-produto mediante a interacción co sitio activo da ADN polimerase ou o seu cofactor (por exemplo, Mg2+ para a ADN polimerase Taq).
Os compoñentes da mostra ou varios tampóns e extractos que conteñen reactivos poden inhibir directamente o encima ou atrapar os seus cofactores (por exemplo, EDTA), inactivando así a polimerase e, á súa vez, provocando unha diminución ou un falso negativo dos resultados da PCR.
Non obstante, moitas interaccións entre os compoñentes da reacción e os ácidos nucleicos que conteñen diana tamén se designan como "inhibidores da PCR". Unha vez que se interrompe a integridade da célula polo illamento e se libera o ácido nucleico, pódense producir interaccións entre a mostra e a súa solución circundante e a fase sólida. Por exemplo, os 'scavengers' poden unirse ao ADN monocatenario ou bicatenario mediante interaccións non covalentes e interferir co illamento e a purificación ao reducir o número de dianas que finalmente chegan ao recipiente de reacción da PCR.
En xeral, os inhibidores da PCR están presentes na maioría dos fluídos corporais e reactivos utilizados para probas de diagnóstico clínico (urea en ouriños, hemoglobina e heparina en sangue), suplementos dietéticos (compoñentes orgánicos, glicóxeno, graxa, ións Ca2+) e compoñentes do ambiente (fenois, metais pesados).

Pódense atopar inhibidores de PCR máis frecuentes en bacterias e células eucariotas, ADN non obxectivo, macromoléculas de unión ao ADN de matrices de tecidos e equipos de laboratorio como luvas e plásticos. A purificación dos ácidos nucleicos durante ou despois da extracción é o método preferido para eliminar os inhibidores da PCR.
Hoxe en día, varios equipos de extracción automatizados poden substituír moitos protocolos manuais, pero nunca se logrou unha recuperación e/ou purificación do 100 % dos obxectivos. Os posibles inhibidores aínda poden estar presentes nos ácidos nucleicos purificados ou poden ter feito efecto. Existen diferentes estratexias para reducir o impacto dos inhibidores. A elección da polimerase adecuada pode ter un impacto significativo na actividade do inhibidor. Outros métodos comprobados para reducir a inhibición da PCR son o aumento da concentración de polimerase ou a aplicación de aditivos como BSA.
A inhibición das reaccións de PCR pódese demostrar mediante o uso do control interno de calidade do proceso (IPC).
Débese ter coidado de eliminar todos os reactivos e outras solucións do kit de extracción, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol e fenol, do illado de ácido nucleico mediante un paso de lavado exhaustivo. Dependendo da súa concentración, poden activar ou inhibir a PCR.