Factores de interferencia nas reaccións de PCR

Durante a reacción de PCR, adoitan atoparse algúns factores interferentes.
Debido á altísima sensibilidade da PCR, a contaminación considérase un dos factores máis importantes que afectan aos resultados da PCR e pode producir resultados falsos positivos.
Igualmente importantes son as diversas fontes que levan a resultados falsos negativos. Se unha ou máis partes esenciais da mestura de PCR ou a propia reacción de amplificación son inhibidas ou interferidas, o ensaio de diagnóstico pode verse dificultado. Isto pode levar a unha eficiencia reducida e mesmo a resultados falsos negativos.
Ademais da inhibición, pode producirse a perda da integridade do ácido nucleico diana debido ás condicións de envío e/ou almacenamento antes da preparación da mostra. En particular, as altas temperaturas ou un almacenamento inadecuado poden danar as células e os ácidos nucleicos. A fixación de células e tecidos e a inclusión en parafina son causas ben coñecidas da fragmentación do ADN e un problema persistente (véxanse as figuras 1 e 2). Nestes casos, nin sequera o illamento e a purificación óptimos axudarán.

Figura 1 | Efecto da inmobilización na integridade do ADN
A electroforese en xel de agarosa mostrou que a calidade do ADN illado de seccións de parafina de autopsias variaba considerablemente. Nos extractos había ADN de diferentes lonxitudes medias de fragmentos dependendo do método de fixación. O ADN só se conservou cando se fixou en mostras conxeladas nativas e en formalina neutra tamponada. O uso dun fixador de Bouin fortemente ácido ou de formalina non tamponada que contén ácido fórmico provocou unha perda significativa de ADN. A fracción restante está moi fragmentada.
Á esquerda, a lonxitude dos fragmentos exprésase en pares de quilobases (kbp)

Figura 2 | Perda de integridade dos ácidos nucleicos diana
(a) Un espazo 3′-5′ en ambas as dúas cadeas provocará unha rotura no ADN diana. A síntese de ADN aínda se producirá no fragmento pequeno. Non obstante, se falta un sitio de hibridación do cebador no fragmento de ADN, só se produce unha amplificación lineal. No caso máis favorable, os fragmentos poden resaturarse entre si, pero os rendementos serán pequenos e estarán por debaixo dos niveis de detección.
(b) A perda de bases, debido principalmente á despurinación e á formación de dímeros de timidina, leva a unha diminución do número de enlaces de hidróxeno e a unha diminución da Tm. Durante a fase de quecemento alongada, os cebadores separáranse do ADN da matriz e non se hibridarán nin sequera en condicións menos estritas.
(c) As bases de timina adxacentes forman un dímero TT.
Outro problema común que adoita ocorrer no diagnóstico molecular é a liberación non óptima dos ácidos nucleicos diana en comparación coa extracción con fenol-cloroformo. En casos extremos, isto pode estar asociado a falsos negativos. Pódese aforrar moito tempo mediante a lise por ebulición ou a dixestión encimática dos restos celulares, pero este método adoita resultar nunha baixa sensibilidade da PCR debido a unha liberación insuficiente de ácidos nucleicos.

Inhibición da actividade da polimerase durante a amplificación

En xeral, a inhibición úsase como un concepto contedor para describir todos os factores que levan a resultados de PCR subóptimos. Nun sentido estritamente bioquímico, a inhibición limítase á actividade do encima, é dicir, reduce ou impide a conversión substrato-produto mediante a interacción co sitio activo da ADN polimerase ou o seu cofactor (por exemplo, Mg2+ para a Taq ADN polimerase).
Os compoñentes da mostra ou varios tampóns e extractos que conteñen reactivos poden inhibir directamente o encima ou atrapar os seus cofactores (por exemplo, EDTA), inactivando así a polimerase e, á súa vez, levando a resultados de PCR diminuídos ou falsos negativos.
Non obstante, moitas interaccións entre os compoñentes da reacción e os ácidos nucleicos que conteñen a diana tamén se denominan "inhibidores da PCR". Unha vez que a integridade da célula se altera mediante o illamento e se libera o ácido nucleico, poden producirse interaccións entre a mostra e a solución circundante e a fase sólida. Por exemplo, os "eliminadores" poden unirse ao ADN monocatenario ou bicatenario a través de interaccións non covalentes e interferir co illamento e a purificación ao reducir o número de dianas que finalmente chegan ao recipiente de reacción da PCR.
En xeral, os inhibidores da PCR están presentes na maioría dos fluídos corporais e reactivos empregados para probas de diagnóstico clínico (urea na urina, hemoglobina e heparina no sangue), suplementos dietéticos (compoñentes orgánicos, glicóxeno, graxas, ións de Ca2+) e compoñentes do medio ambiente (fenois, metais pesados).

Os inhibidores da PCR máis frecuentes pódense atopar en bacterias e células eucariotas, ADN non diana, macromoléculas de unión ao ADN de matrices de tecidos e equipamento de laboratorio como luvas e plásticos. A purificación de ácidos nucleicos durante ou despois da extracción é o método preferido para eliminar os inhibidores da PCR.
Hoxe en día, varios equipos de extracción automatizados poden substituír moitos protocolos manuais, pero nunca se conseguiu unha recuperación e/ou purificación do 100 % dos obxectivos. Os potenciais inhibidores poden estar aínda presentes nos ácidos nucleicos purificados ou poden ter xa feito efecto. Existen diferentes estratexias para reducir o impacto dos inhibidores. A elección da polimerase axeitada pode ter un impacto significativo na actividade dos inhibidores. Outros métodos probados para reducir a inhibición da PCR son aumentar a concentración de polimerase ou aplicar aditivos como a BSA.
A inhibición das reaccións de PCR pódese demostrar mediante o uso do control interno de calidade do proceso (IPC).
Débese ter coidado de eliminar todos os reactivos e outras solucións do kit de extracción, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol e fenol, do illado de ácido nucleico mediante un paso de lavado completo. Dependendo da súa concentración, poden activar ou inhibir a PCR.