Factores de interferencia nas reaccións de PCR

Durante a reacción de PCR, adoitan atoparse algúns factores interferidores.
Debido á moi alta sensibilidade da PCR, considérase que a contaminación é un dos factores máis importantes que afectan aos resultados da PCR e pode producir resultados positivos falsos.
Igualmente críticos son as diversas fontes que levan a resultados falsos-negativos. Se se inhiben ou interfiren unha ou varias partes esenciais da mestura de PCR ou a reacción de amplificación, pódese dificultar o ensaio de diagnóstico. Isto pode levar a unha eficiencia reducida e incluso resultados negativos falsos.
Ademais da inhibición, a perda de integridade do ácido nucleico diana pode producirse debido ao envío e/ou condicións de almacenamento antes da preparación da mostra. En particular, altas temperaturas ou almacenamento inadecuado poden provocar danos de células e ácidos nucleicos. A fixación de células e tecidos e a inserción de parafina son causas coñecidas de fragmentación do ADN e un problema persistente (ver figuras 1 e 2). Nestes casos, incluso o illamento e a purificación óptimos non axudarán.

Figura 1 | Efecto da inmobilización na integridade do ADN
A electroforese en xel de agarosa demostrou que a calidade do ADN illado das seccións de parafina das autopsias variaba considerablemente. O ADN de diferentes lonxitudes de fragmento medio estivo presente nos extractos dependendo do método de fixación. O ADN só se conservou cando se fixou en mostras conxeladas nativas e en formalina neutral tamponada. O uso dun fixador de bouin fortemente ácido ou non baseado, formalina que contén ácido fórmico deu lugar a unha importante perda de ADN. A fracción restante está moi fragmentada.
Á esquerda, a lonxitude de fragmentos exprésase en pares de kilobase (KBP)

Figura 2 | Perda de integridade dos obxectivos de ácido nucleico
(A) Unha brecha de 3′-5 'nas dúas febras producirá unha rotura no ADN obxectivo. A síntese de ADN aínda se producirá no pequeno fragmento. Non obstante, se falta un sitio de recocido de cebador no fragmento de ADN, só se produce unha amplificación lineal. No caso máis favorable, os fragmentos poden resaturarse entre si, pero os rendementos estarán pequenos e por baixo dos niveis de detección.
(b) A perda de bases, principalmente debido á depuración e á formación de dímero de timidina, leva a unha diminución do número de enlaces H e unha diminución da TM. Durante a fase de quecemento alongado, os cebadores derreteranse do ADN da matriz e non se recocirán nin sequera en condicións menos rigorosas.
(c) As bases de timina adxacentes forman un dímero TT.
Outro problema común que adoita ocorrer nos diagnósticos moleculares é a liberación menos que óptima de ácidos nucleicos diana en comparación coa extracción de fenol-cloroformo. En casos extremos, isto pode asociarse a falsos negativos. Pódese aforrar moito tempo por lise fervendo ou dixestión enzimática de restos celulares, pero este método adoita producir unha baixa sensibilidade á PCR debido á liberación de ácido nucleico insuficiente.

Inhibición da actividade da polimerase durante a amplificación

En xeral, a inhibición úsase como concepto de contedor para describir todos os factores que levan a resultados de PCR subóptimos. Nun sentido estrictamente bioquímico, a inhibición está limitada á actividade do encima, é dicir, reduce ou impide a conversión de produtos de substrato mediante a interacción co sitio activo da ADN polimerase ou o seu cofactor (por exemplo, Mg2+ para o ADN polimerase Taq).
Os compoñentes da mostra ou diversos buffers e extractos que conteñen reactivos poden inhibir directamente a enzima ou atrapar os seus cofactores (por exemplo EDTA), inactivando así a polimerase e provocando unha diminución ou falsos resultados de PCR negativos.
Non obstante, moitas interaccións entre compoñentes de reacción e ácidos nucleicos que conteñen obxectivos tamén se designan como "inhibidores da PCR". Unha vez que a integridade da célula é interrompida polo illamento e o ácido nucleico é liberado, pode producirse interaccións entre a mostra e a súa solución circundante e fase sólida. Por exemplo, os "escavadores" poden unir o ADN monocatenario ou de dobre cadea a través de interaccións non covalentes e interferir co illamento e a purificación reducindo o número de obxectivos que finalmente alcanzan o vaso de reacción PCR.
En xeral, os inhibidores da PCR están presentes na maioría dos fluídos corporais e reactivos empregados para probas de diagnóstico clínico (urea en urina, hemoglobina e heparina en sangue), suplementos dietéticos (compoñentes orgánicos, glicóxeno, graxa, iones Ca2+) e compoñentes no ambiente (fenoles, metais pesados)

Pódense atopar inhibidores de PCR máis prevalentes en bacterias e células eucariotas, ADN non obxectivo, macromoléculas de unión ao ADN de matrices de tecidos e equipos de laboratorio como luvas e plásticos. A purificación de ácidos nucleicos durante a extracción ou despois da extracción é o método preferido para eliminar os inhibidores da PCR.
Hoxe, varios equipos de extracción automatizados poden substituír moitos protocolos manuais, pero nunca se logrou a recuperación do 100% e/ou purificación de obxectivos. Os potenciais inhibidores aínda poden estar presentes nos ácidos nucleicos purificados ou poden ter efecto xa. Existen diferentes estratexias para reducir o impacto dos inhibidores. A elección da polimerase adecuada pode ter un impacto significativo na actividade inhibidora. Outros métodos comprobados para reducir a inhibición da PCR son aumentando a concentración de polimerase ou aplicando aditivos como a BSA.
A inhibición das reaccións de PCR pódese demostrar mediante o uso do control de calidade do proceso interno (IPC).
Hai que ter coidado de eliminar todos os reactivos e outras solucións no kit de extracción, como etanol, EDTA, Cetab, LiCl, Guscn, SDS, isopropanol e fenol, a partir do illado do ácido nucleico por un paso completo de lavado. Dependendo da súa concentración, poden activar ou inhibir a PCR.